文字/编辑：一口半夏

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硫醇依赖的氧化还原调节影响着植物细胞内的核心生物过程，特别是光合作用领域，例如Calvin-Benson循环酶，受到硫氧还蛋白还原激活的精准调控，虽然关于这一项激活机制已有研究，但氧化失活的具体机理仍未完全阐明。

为了深入研究这一问题，我们对丰富的2-半胱氨酸过氧还原素（2-CysPrx）进行了详尽研究，特别是将其与位点定向变异进行了对比分析。

主要为了鉴定出，在适当的硫氧还蛋白酶存在下，2-CysPrx是否能够介导果糖-1,6-双磷酸酶以及NADPH依赖性苹果酸脱氢酶（MDH）的还原激活，并在这一特定条件下，探究这些酶是否会快速失活。

同时本研究通过与野生型进行对比，探究磷酸丁激酶（PRK）和MDH在2cysprxAB突变植物中的失活情况，以及由此导致的这些突变植物进入光/暗转换状态。

在实验条件下，缺乏2-CysPrx的Salix aliana幼苗在发育过程中出现迟缓，且其光合作用存在缺陷，同时我们展示了WT幼苗与缺乏2-CysPrx的亲环素的幼苗的叶绿素a-荧光瞬变20-3。

这些幼苗分别在固化的Murashige Skoog+培养基和负蔗糖的培养基上生长，在光照持续16.5小时后，野生型和环丙沙星幼苗，都显现了叶绿素a荧光发射的考茨基峰，随后缓慢降低至新的稳定状态。

在对比实验中，2cysprxAB突变体在没有蔗糖的情况下表现出较小的荧光增强，而在蔗糖存在的情况下，荧光增强较小。

同时Kautsky效应所展现的现象表明了在光照的第一阶段，电子传递链的减少，随后在NADPH和ATP的消耗代谢途径激活的过程中发生再氧化，特别是在Calvin-Benson循环（CBC）和苹果酸脱氢酶所在的膜上。

荧光峰的缺失现象，初步解释为2cysprxAB突变体中，暗期仍然存在非光化学或光化学淬灭活动的能量汇和能量耗散机制，这种现象表明在黑暗中存在预激活状态，与2-CysPrx的特性相关。

本研究选用叶绿体中的果糖-1，6-双磷酸酶（FBPase）和依赖于NADPH的苹果酸脱氢酶（MDH）作为两个典型的光激活酶，用以探讨2-CysPrx对氧化还原蛋白激活状态的影响。

从分离的完整叶绿体中获得基质蛋白，并进行叶绿体Trxs和2-CysPrxA的重组蛋白制备，采用预处理基质提取物，将1mm二硫苏糖醇（DTT）对FBP酶进行还原激活。

在1∶1稀释后（残留的DTT浓度为500μM），通过添加底物FBP，进行了体外培养实验，基质中的FBP酶能够有效地将FBP转化为Fru-6-P，这在吸收光谱上表现为时间依赖性的增加。

TRX-F1的添加略微提高了FBPase的活性，这表明在预孵育过程中，FBPase的激活尚未充分实现，因此，在残留500 μM DTT的情况下，TRX-F1能够进一步减少和激活FBPase。

在不含TRX的条件下，加入氧化的2-CysPrx后，FBP酶的活性基本保持不变，然而，如果在重组实验中同时加入还原态的间质、TRX-F1和氧化的2-CysPrx，那么FBPase的活性明显被抑制。

显然，TRX-F1通过将电子从还原的FBPase转移到2-CysPrx而介导FBPase的氧化失活，作为附加对照，我们将减少的2-CysPrx加入到还原态的基质中，并建立单独使用Trx-f1相同的活性实验。

在没有DTT的条件下FBPase未表现出活性，但将DTT浓度从1 mM降低至400μM后，添加还原态的Trx-f1可以进一步激活FBPase的活性。

添加2-CysPrx无论在还原条件下还是在氧化条件下，都未对基质中的FBPase活性产生影响，在使用胰蛋白酶进行酶活性测定后，我们发现抑制率达到76%，与2-CysPrx所揭示的情况一致，这种抑制作用能够迅速发生。

在正在进行的酶反应中加入胰蛋白酶后，基质中的FBPase减少，并在完全重组实验中，随着MPEG 24每个分子中2个分子的引入，这种减少现象更为显著。

当同时加入间质、还原态的TRX-F1和氧化态的2-CysPrx时，同样的抑制作用在纯重组蛋白实验中也得以复现。

这种抑制作用的效率与Trx-f1的浓度相关，在存在0.625μM Trx-f1时，抑制效果较低，而在存在5μM Trx-f1时，抑制效果明显增强，表明抑制作用随着Trx-f1浓度的增加而逐渐饱和。

在过氧化物（如H2O2）的解毒反应中，2-CysPrx利用两种Cys-残基，即过氧化物Cys 54和还原Cys 176，通过对2-CysPrx的位点定向突变，我们探究了2-CysPrx的氧化态对还原型硫醇存在的催化活性的依赖性。

变异体C54S、C176S以及模仿过氧化物Cys 54的突变体C54D都未能对FBPase产生抑制作用，这表明这两个硫醇残基是必不可少的。

相反，F84R突变体在氧化还原能力方面受到损害，但在完全氧化试验中仍然能够作为巯基过氧化物酶有效地抑制FBPase。

在数学模型体外培养实验中，我们将结果与加入不同浓度的氧化态2-CysPrx进行酶测定的实验结果进行了比较，通过添加2.5、5或10微米的氧化态2-CysPrx，吸收光谱的变化表明，Fru-6-P向Fru-1,6-P2的转化逐渐受到抑制。

模拟的开始阶段显示，在存在5μM Trx-f1的情况下，FBPase被完全激活。

在加入2-CysPrx的情况下，当其浓度为2.5、5、10或20μM时，能够导致迅速的部分抑制和浓度依赖性的Fru-6-P转化，这与实验数据高度吻合。

从实验结果来看，NADPH依赖性苹果酸脱氢酶(MDH)是叶绿体氧化还原调节的另一个靶点。

MDH受到TRX-m的激活，特别是在基质的还原电位变成极负的情况下，例如在光照过量时，MDH的还原预激活促使草酰乙酸转化为苹果酸，并伴随NADPH的氧化过程。

在添加氧化的2-CysPrx时，MDH的活性不受影响，而还原剂DTT能够完全激活其活性。

然而，在预孵育过程中添加不同类型的Trxs后，加入2-CysPrx，MDH的活性受到抑制，这强调了TRX-M1在2-CysPrx介导的MDH完全抑制中的中介作用。

实验研究发现，氧化使还原激活的蛋白质失活被认为是，光合作用中降低光子通量密度和使之变暗所必需的，并且抑制CBC酶、ATP合成酶和MDH能够有效地防止代谢产物的过度消耗，从而抑制无效循环和持续的能量耗散。

我们测定了受过强光照射的WT植物叶片提取物中的MDH活性，并进行了相关分析，在变暗过程中，2cysprxAB突变体的介入，使得MDH的失活状态在WT中迅速发生，而在2cysprxAB中则受到了一定程度的抑制。

与此相对应，经过10秒的暗化后，WT、C1和C2之间的MDH失活状态呈现明显的差异，其中2cysprxAB的失活程度较低。

在经过10天的黑暗处理后，MDH的残余活性相较于初始0秒时，在2cysprxAB、C1和C2中分别为55.8%、90.9%、61.0%和73.2%，C1和C2分别代表在2cysprxAB的遗传背景下，通过内源启动子调控表达2-CysPrxA的植物。

为了研究 2cysprxAB 在光诱导下的逆转，我们选取5-磷酸核糖激酶（PRK）作为另一个还原活化的CBC酶，它在光合作用中催化5-二磷酸核酮糖生成，进行RuBP的羧化/氧化反应。

PRK活动的时间过程是在光明-黑暗的过渡过程中进行的，随着黑暗的发展，wt的失活表现为失活，而 2cysprxAB 在300秒的时间段内表现出不同的失活速率，而互补系C1和C2则在300秒后都显示出一定程度的抑制作用，类似于WT的情况。

为了解决缺乏2-CysPrx的更全面的影响，我们在实验过程中通过测量不溶性酸水解碳水化合物来研究相关情况。

不溶性碳水化合物含量在光照期增加2.6倍，夜间2cysprxAB突变体的碳水化合物含量高于40%，且在暗相末端达到与WT相似的水平，2cysprxAB突变体也出现了一定的延迟。

本研究在西葫芦叶片中测定了FD的再氧化速率，使用近红外动力学LED光谱仪（NIR-KLAS-100），对2cysprxAB突变体以及补充系C1和C2的叶片进行了实验。

在适应暗环境后，以162μmol量子米的短1.5秒光脉冲照射暗适应的叶片，然后立即切换至暗环境，这短暂的光照时间内，会将FD池光会被还原。

实验结果表明，Fd池的再氧化过程与叶片在785nm和840 nm的近红外吸收存在明显差异。

在野生型植物中，Fd池的再氧化半衰期为416±81毫秒，而2cysprxAB突变体的Fd再氧化半衰期为t50 和120±35ms (n=5，m±SD)，在2-CysPrx缺失的情况下，氧化速率显著增加了3.5倍。

这一减缓在t 50 值上表明，在wt中，电子消耗反应的氧化失活是有效的，而在缺乏2-CysPrxAB的植物中，明显受到延迟。

然而，通过补充系C1和C2，2cysprxAB的快速衰减率完全恢复到了wt水平，其值分别为408±56毫秒和386±47毫秒。

研究还评估了2-CysPrx的氧化还原状态在光-暗转换过程中的变化，在使用N-乙基马来酰亚胺封闭样品的非还原凝胶分离中，约22 kDa的2-CysPrx单体与还原组分相对应。

而44 kDa处的二聚体代表完全或部分氧化形式，在光照条件下，2-CysPrx总量的约40%被降低，而在黑暗中逐渐增加。

这一分数在光转暗阶段增加，然后在延长的黑暗中减少中选择所需的构件，同时，2-CysPrx在光和黑暗中均发生氧化，在光跃迁过程中会发生短暂的变化，这也表明其参与了TRX和TRX依赖的靶标的氧化过程。

在研究中，我们观察到了一些显著差异，除了在光转换和光/暗转换过程中参与代谢调节外，2-CysPrx的缺乏还对植物的发育和代谢产生了其他影响。

在连续光照和波动光照条件下的生长数据和WT/2cysprxAB的比较下，2cysprxAB的生长表现较差。

而在80秒弱光（L）和10秒强光（H）的波动光照中，2cysprxAB的生长表现最佳，这些结果进一步突显了2-CysPrx在植物生长和光调控中的互补。

氧化还原调节的Trx依赖性还原途径参与了众多细胞过程的调控，只有通过精细调控还原和氧化之间的相互作用，才能实现高效的调节。

过氧化氢（H2O2）的中心作用在细胞发展和适应中被广泛接受，在研究过程中氧化剂（S）的性质必须符合多个标准，特别是涉及其特异性、热力学性质（包括中点氧化还原电位）以及足够数量的氧化剂缓冲液。

我们研究结果表明，叶绿体中的2-CysPrx具备过氧化物依赖性硫氧还蛋白氧化酶的功能。

同时根据这项结果，可以得出结论，2-CysPrx作为Trx氧化酶的功能，从而介导了TRX依赖的靶蛋白失活，这一机制需要在黑暗中或光合活性辐射下降的情况下，有效地灭活或下调与光合电子传递链相关的同化途径。

除了对cbc和苹果酸阀的调控外，此机制还影响其他代谢过程，如白天淀粉积累和非光化学淬灭，因此2-CysPrx担任着调节叶绿体氧化还原调节网络的参与者。

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