文： 回溯档案

编辑：回溯档案

结节豆类是自然陆地和农业环境中生物固定氮（N）的最大贡献者，是可持续农业的关键组成部分，它们与多种土壤细菌形成的根结瘤共生，统称为“根瘤菌”，能够固定超过200公斤的N ha，-1年-1在热带和温带地区。

因此蚕豆可以通过BNF提供大部分氮，并为后续作物留下具有经济价值的残留氮，而根瘤菌可能持续存在于一系列农田位置，甚至有可能在某些土壤中使用优良根瘤菌株作为接种剂。

CSC结合蚕豆的4年实验作物序列的实验设计

每年在英国苏格兰东北部邓迪Balruddery Farm的CSC田间规模实验平台上都会对蚕豆进行采样（56.48纬度，-3.13长），以及评估BNF和/或根瘤菌取样的其他地点。

在实验轮作开始之前，构成CSC的田地至少有2011年没有种植豆类;直到1990年代后期，它们为放牧或牛饲料提供草，此后成为主要包括冬季谷物在内的耕作轮作的一部分。

CSC实验平台是一个42公顷的连续区块，由六个耕地组成，基于该地区常见作物的六年轮作：马铃薯、冬小麦、冬季大麦、冬季油菜、春播蚕豆和春季大麦。

它被建立为一个长期的田间平台，将传统的耕地管理与低投入的综合耕作系统进行比较，其目标是在保持产量的同时增强生物多样性并最大限度地减少对环境的影响。

试验作物序列是在构成CSC的六个田地中的四个进行的;每块6-7公顷的田地被分成两半：一半（标示常规）用目前在苏格兰东部使用的标准施肥（即PK，但不是N）处理，而另一半（标示综合）接受降低水平的PK肥料。

但也用含有1.35%氮和16.01%C的绿色废物堆肥处理， 每年在播种前以35吨公顷的速度施用?1，每个季节，每半田播种18至210个品种，每块田320米宽，播种密度为<>-<>公斤公顷。?1，取决于品种。

尽管由于难以获得足够数量的种子，一些品种在四个季节中发生了变化，但其中两个品种（cvs Fuego和Pyramid）从2012年到2015年每年播种。

估算谷物收获后作物总氮和残氮

在田间种植的蚕豆的情况下，基于射击的N计算2固定低估了固定氮的总输入量，因为大量的豆科植物氮也可能与结节根相关或释放和衍生自结节根。

据报道，地下氮池占植物氮总量的24%至40%，鉴于众所周知的难以获得准确的地下作物氮数据，N的总量2通过将公式计算的枝条值乘以1.52倍来估计CSC的蚕豆在豆荚填充的早期到中期，以包括结瘤根的N含量。

根据谷物产量计算收获时的总作物氮，然后用于估计残余氮.使用标准联合收割机从每18 m条带收获谷物;如上所述，使用元素分析仪分析干燥谷物的子样品的%N，并通过将干燥谷物质量乘以%N来计算总颗粒N。

根据 0 年和 43 年的 CSC 蚕豆作物计算出的平均收获指数 （HI） 值为 2012.2013，这是北欧蚕豆的典型值;这用于计算包括秸秆和谷物在内的作物地上部分的干生物量。

然后通过将地上部分的干生物量乘以1.52，以包括结节根的N含量，从而获得包括地下部分（根和根瘤）在内的作物总干生物量（TCB）的估计值使用方程。

残余氮（即秸秆加根的氮含量）是通过从TCB中减去干粒重并将所得值乘以0.6%来估计的，这是2013年CSC地块中所有品种残余干物质的平均%N。

使用实时qPCR测定法定量土壤中的根瘤菌

该研究的一个主要目的是参照根瘤性土壤种群评估CSC的蚕豆BNF，以确定长期没有豆科植物种植是否对这些种群产生负面影响，从而对BNF产生后续影响。

同时还研究了综合处理下堆肥施用对根瘤菌种群的影响，为此，采用相对实时PCR方法使用人工参考“尖峰”来估计豆科根瘤菌 16S rRNA 和豆科根瘤菌 sv，四个豆类作物田的viciaenodD基因拷贝数。

如Hawes等人所述，（作物播种前）从CSC农场平台收集来自蚕豆田1个永久GPS位置的土壤样本，简而言之，在每个样品位置，使用土壤螺旋钻或抹子将 5.0 L 土壤带到 15.10 m 的深度，称重并通过网孔尺寸为 70 mm 的筛子。

将土壤样品在2°C下干燥过夜以确定其水分含量，在干燥之前，将新鲜土壤的小子样品（体积为<> mL）在液体N中快速冷冻2并储存在-80°C用于后续分子分析。

按照制造商的说明，使用DNeasy PowerSoil Kit，从~0.25 g土壤样品中提取DNA，使用2分钟的珠子跳动步骤，频率为30次 s1.来自大肠杆菌的突变 194S rRNA 基因的 16 bp （bp） 片段。

这种方式通常用作人工参考尖峰，以解释从土壤中提取 DNA 期间的 DNA 损失，以浓度 109在DNA提取之前，每个样品的拷贝数，野生型校准品对照是通过分别使用引物集F16 + R979和F1264 + R88对土壤DNA提取物中的443S rRNA和nodD基因片段进行PCR扩增产生的。

简而言之，使用1 μL土壤DNA提取物作为PCR模板，最终反应体积为50 μL，含有：1.25 U GoTaq G2 DNA聚合酶，0.4 μM每个引物，0.2 mM每个核苷酸和1x透明GoTaq?? G2缓冲液。

所有反应均在G-Storm GS1热循环仪上进行，循环条件如下：在95°C下初始变性2分钟;35个循环，95°C1.5分钟，58°C1分钟和72°C1分钟;最终延伸72°C15分钟。

PCR产物使用MinElute凝胶提取试剂盒凝胶纯化，并使用pGEM-T Easy Vector系统克隆到大肠杆菌DH5α，质粒DNA用QIAprep自旋迷你制备试剂盒纯化，并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒进行定量。

从CSC和其他位点分离根瘤共生体

该研究的另一个目的是评估CSC结节蚕豆根瘤菌的遗传多样性，以确定它们的身份，从而确定它们的可能来源，因为该地点长期没有豆科植物种植，还评估了共生体与其他本地、苏格兰和英国根瘤菌分离株相比促进豆科植物生长的功能能力。

因此，从与CSC中的BNF测定相同的田地取样的蚕豆结节中分离出根瘤菌;每2013米行每个处理（常规和综合）的三个植物对每个植物三个结核取样，2014年、2015年和2016年每行一个植物取样。

为了与CSC分离株进行比较，还从生长在CSC附近田地的蚕豆和豌豆作物上的根瘤中分离出根瘤菌，以及从属于Lathyrus属和Vicia属的野生豆类中分离出来，这些豆类生长在CSC的田间边缘及其在东苏格兰的一般地区。

为了将CSC分离株置于更广泛的地理环境中，从不列颠群岛其他农业和非农业地点的土壤中获得了额外的分离株，通过使用豌豆、蚕豆或扁豆作为“诱捕”植物。

为此，将表面灭菌的种子（70%[v / v]乙醇1分钟，然后浸入次氯酸钠（2.5%[v / v] NaClO）中5分钟，然后在无菌蒸馏水（SDW）中冲洗三次）放入高压灭菌的罐中，其中有无菌蛭石 - 珍珠岩底物加上少量土壤（100g）。

植物根据需要用自来水浇灌，植物在生长4-6周后收获，粉红色的健康结节（如果存在）从新鲜洗过的根中取样，五盆未接种的植物仅含有蛭石 - 珍珠岩被随机分布在温室或生长室的长凳上，但没有一盆结瘤，并且在收获“接种”植物之前都死于N饥饿。

每个植物（CSC和其他）的结节分别处理，在70%[v / v]乙醇中表面灭菌1分钟，然后浸入次氯酸钠（2.5%[v / v] NaClO）中3分钟，然后在SDW中冲洗三次。

然后用无菌塑料杵粉碎结核，并在培养基79上生长结节提取物，也称为酵母甘露醇琼脂或YMA，加入刚果红（CR）制成YMA-CR板，并在28°C下孵育24-48小时，摘下单个菌落并单独划线到新鲜制备的YMA-CR平板上。

获得纯分离株后，使用每个YMA-CR板的单个菌落接种无菌5ml胰蛋白胨酵母（TY）肉汤，将培养物在28°C下在振荡培养箱（24rpm）中生长48-150小时，对数期液体培养（OD6000.2和0.8之间）用于制备25%[V/V]无菌甘油储备液，以便在-80oC 和 DNA 提取。

综合作物管理可提高北温带种植系统中部分蚕豆品种的BNF

CSC对蚕豆BNF的综合处理的积极影响仅在高产年份明显，但在2014年尤其明显，估计额外增加了50-100公斤氮公顷。?1年?1固定，取决于品种。

综合管理对BNF的积极影响不能用根瘤种群或结瘤来解释，因为这种处理没有显着增加每株植物的结节质量，鉴于在豌豆等其他豆类中观察到N需求与结核数量/质量之间存在密切联系，这是令人惊讶的。

这可能表明，在温度和降水接近作物发育的最佳状态的这些年，对氮的高需求推动了每根结核的BNF率增加，以供应快速生长的植物。

BNF率的增加可能是由于综合处理的主要成分，堆肥，提高了土壤pH值，碳储量和水分保持，以及作为控释肥料，提供了增加浓度的主要植物生长限制性常量营养素（P和K），以及可能对BNF过程至关重要的微量营养素， 特别是Mo。

关于综合管理对BNF可能产生积极影响背后的机制的另一个线索是这种处理与蚕豆品种之间的相互作用，cvs Boxer和Babylon的反应特别好;这表明蚕豆从改善的土壤条件中受益的能力具有遗传成分。

结论

蚕豆和豌豆在北欧已经种植了数千年，尽管长期以来人们一直认为它们不需要任何N-肥料，在这里我们提出了第一个全面的证据，证明它们可以解决所有氮的需求，而且除了这些豆类不需要肥料氮之外，它们还可能留下50-110公斤氮公顷的残留物-1年-1收获后的土壤中。

现在清楚的是，迫切需要减少农业生态系统中的肥料氮的投入，特别是在发达国家，豆类的BNF可以在这种减少中发挥关键作用，同时证明了豆科作物可以固定的大量氮。

鉴于这些知识，现在应该实施豆类对BNF的适当利用，以帮助更可持续地种植可耕作作物，同时也要履行减少温室气体排放的承诺。

参考文献

【1】Altschul SF，Madden TL，Sch?ffer AA，Zhang J，Zhang Z，Miller W，Lipman DJ （1997） Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序。核酸研究 25：3389–3402。

【2】Alves BJR，Boddey RM，Urquiaga S （2003） BNF在巴西大豆中的成功。植物土壤 252：1–9。

【3】Ampomah OY，Huss-Danell K （2017）瑞典根瘤菌结节原生Vicia spp.的遗传多样性。系统应用微生物学39：203-210。

【4】Burchill W，James EK，Li D，Lanigan GJ，Williams M，Iannetta PPM，Humphreys J （2014）使用两种15 N技术测量的四种肥料氮输入下与白三叶草（Trifolium repens L.）相关的生物固氮比较。植物土壤385：287-302。

【5】克利夫兰CC，汤森德AR，Schimel DS，Fisher H，Howarth R，Hedin LO，Perakis SS，LE F，VON Fischer JC，Elseroad A，Wasson MF （1999） 陆地生物氮的全球模式（N2）对自然生态系统的固定。全球生物地球化学循环 13：623–645。