图1：说明荧光显微镜中的光学滤光片和光路的图解。
荧光显微镜和成像系统利用荧光生物标记物和荧光滤光片组，生成生物分子、细胞器、细胞、组织、器官和器官系统的明亮、高对比度图像。由于图像质量在很大程度上取决于集成到这些系统中的荧光滤光片的设计和整体性能，因此光学滤光片的性能对于最终图像与样品制备和荧光团选择同样重要。
荧光
当特定波长的光子被原子或分子吸收时，轨道电子会从基态（S0）跃迁到激发单线态（S1）。当电子返回到基态时，会发射出能量较低的光子，因此波长比最初吸收的光子长（图2）。这种现象被称为荧光，是生物科学和医学中使用的各种仪器背后的关键概念。荧光显微镜、成像系统、流式细胞仪和DNA测序仪都使用光源，如激光、LED或宽带灯，来激发样品中的荧光标记。荧光滤光片用于分离和引导激发信号到样品，并将发射信号引导到检测器或目镜（图1）。
在某些情况下，单个原子或分子可以同时吸收多个长波光子，从而产生能量更高、波长更短的发射光子，而不是最初吸收的光子（图2）。这种非线性荧光响应被用于双光子和多光子荧光显微镜系统。然而，处于激发态的电子也可以通过显微镜中使用的其他过程返回到基态；这些包括荧光共振能量转移(FRET)和受激发射损耗(STED)。
图2：展示了线性荧光（左）和双光子激发（右）之间的区别。
荧光标记
使用荧光研究的样本通常被标记或自然包含一种称为荧光团（或荧光染料）的物质，这些物质因其芳香化学结构的特性而发出相对较强的发射信号。所有荧光团都具有独特的吸收（或激发）光谱和独特的发射光谱，每个光谱都在特定波长处达到能量或强度的峰值。给定荧光团的峰吸收和峰发射之间的波长差异称为斯托克斯位移（图3），范围可以从几纳米到几百纳米不等。
图3：异硫氰酸荧光素（FITC）的吸收和发射光谱。斯托克斯位移是光谱峰之间的差异。
有各种各样的荧光蛋白、探针、染料和其他荧光团可以用作荧光标签。它们每一个都具有不同的激发和发射光谱以及不同的斯托克斯位移，并且在亮度、成熟时间和光稳定性方面都有所不同。此外，发射强度取决于荧光团吸收的光的波长；对应于峰值吸收的光将产生最大发射强度，而远离吸收峰的波长产生的发射信号强度较低。发射信号强度还取决于被标记分子的浓度。例如，有些荧光系统被设计为检测来自单个分子的发射信号。
荧光滤光片组
为了上置荧光显微镜和其他标准荧光显微镜能正常工作，需要三种类型的光学滤光片：（1）激发滤光片，（2）发射滤光片，和（3）二向色分束器（图1和图4）。激发和发射滤光片是带通滤光片，它们透射与各自荧光团吸收或发射光谱相对应的波长范围，同时阻挡两侧的杂散光。然而，如果希望图像亮度超过对比度，发射滤光片也可以是长通边缘滤光片，透射较长的波长而不是阻挡它们。大多数二向色分束器是设计用于45°入射角（AOI）的长通滤光片。二向色滤光片将过滤后的激发光引导到样本，并将来自样本的发射光通过发射滤光片引导到探测器（图1）。
图4：为FITC设计的一款荧光滤光片组。
荧光滤光片组可以是单波段或多波段的，并且以多种配置存在，最常见的是荧光滤光片立方体和滤光片转轮。通过使用各自对应的滤光片立方体拍摄一系列图像，然后创建最终的合成图像，单波段滤光片组可以用于观察用多个荧光团标记的样本。通过使用Pinkel或Sedat滤光片转轮配置也可以实现这一点。Pinkel滤光片组由一个多波段发射滤光片和一个多色滤光片组成，与多个单波段激发滤光片一起使用。Sedat滤光片组由一个多色滤光片组成，与多个单波段激发和发射滤光片一起使用。
也可以使用由多波段激发滤光片、多波段发射滤光片和多色滤光片组成的全多波段滤光片组，它将产生一个包含所有荧光标签的单一图像。
荧光滤光片组要求
为了构建一个能够产生高质量图像的荧光滤光片组，其图像应具有黑色背景和高对比度，激发和发射滤光片应在与荧光团激发或发射的峰值相对应的区域上实现高透射率和最小的通带波动，并且它们的各自通带应该分开，以便重叠不会发生在OD7（-70dB或0.00001%透射率）的水平以上（图5）。然而，当使用具有非常短斯托克斯位移的荧光团时，或者在某些多波段滤光片组的情况下，OD6（-60dB或0.0001%透射率）或OD5（-50dB或0.001%透射率）的交叉是可以接受的。
图5：高性能荧光滤光片组的图表。旨在提供高对比度和黑色背景的特性被突出显示。
为了实现OD7交叉，荧光滤光片应该作为一个整体进行指定和设计。激发和发射滤光片还必须设计有陡峭的边缘，这些边缘在几纳米内从OD6阻挡过渡到超过90%的透射率，以便让通带捕捉到相应的荧光团峰值。大多数荧光滤光片组的设计使得激发和发射滤光片的理论轨迹交叉超过OD7，以考虑到制造公差。由于涂覆滤光片的测量光谱可能与理论有所偏差，因此指定这些滤光片的方式也必须确保适当的交叉。例如，可以指定相对严格的中心波长公差，或者指定绝对的透射或阻挡范围而不是平均值。
为了获得黑色背景，激发和发射滤光片应设计为阻挡任何外来光。这是通过指定宽范围的带外阻挡范围在OD6或更高级别来实现的。利用宽带光源的系统需要从~300 nm到~1100 nm的带外阻挡范围，而可切换的LED光源需要从~300 nm到~850 nm的带外阻挡。激光系统的发射滤光片需要在激光线上至少有OD6的绝对阻挡，而带外阻挡范围可以类似于LED光源的发射滤光片。如果环境光不是问题，那么激光系统的激发滤光片可能不需要超出发射滤光片通带的广泛阻挡。
二向色滤光片也需要在反射带和透射带之间有一个相对陡峭的过渡，以便将截止边缘放置在激发和发射滤光片的通带之间。此外，所有将光传输到探测器或目镜的滤光片都应该指定低透射波前误差（TWE），以避免图像失真。
二向色平整度
二向色分束器的表面平整度是在选择适用于激光、成像、全内反射荧光（TIRF）和超分辨率系统的荧光滤光片组时需要考虑的一个特性。当薄膜涂层沉积到基板上时，涂层的应力会导致基板弯曲，从而产生碗状或圆顶状的曲率（图6）。这种由涂层应力引起的曲率会导致反射波前误差（RWE）增加，这可能会导致这些系统中的焦点偏移和光斑大小失真。因此，需要使用低应力涂层（图7）或背面补偿来避免失真。
图6：显示了涂层应力引起的曲率，这可能导致图像失真。
图7：显示了一个具有低涂层应力的平整二向色滤光片。
零像素移动
荧光滤光片应指定为在切换滤光片以对单个样本中的多种荧光团进行成像的任何配置中使用时产生零像素偏移。这些配置包括单波段滤光片组、Pinkel集和Sedat集。在这些配置中使用的发射滤光片和二向色滤光片应由同一制造商提供，并指定具有高度平行度，以最小化楔角引起的光束偏差。由于大多数滤光片并非完全平行，并且涂层应力会引入一定程度的光束偏差，因此在将光学滤光片引入系统前后拍摄的图像之间会发生一定程度的像素偏移。然而，当比较使用旨在协同工作的零像素偏移套件拍摄的图像时，偏移应小于大约±1像素。
最小化荧光团串扰
在使用多波段和Pinkel套件对标记有多个荧光团的样本进行成像时，最小化荧光团之间的串扰是很重要的。对于荧光原位杂交（FISH）、FRET和流式细胞术应用来说，最小化串扰也是一个重要的考虑因素。串扰或渗漏发生时，一个荧光团的激发和发射信号通过为另一个荧光团保留的滤光片通道传输，导致单个位置的颜色混合，模仿共定位的效果。虽然一定程度的串扰是不可避免的，但选择能够最小化这种效果的荧光团和滤光片组是很重要的。这可以通过避免在其各自发射光谱之间有大量重叠的荧光团组合来实现。在每个荧光团由不同的LED或激光激发的情况下，也应避免吸收光谱之间的重叠。不管选择哪种荧光团，激发和发射滤光片应设计成具有相对较窄的通带，以捕捉目标荧光团的峰值激发或发射，同时尽可能阻挡重叠部分（图8）。
图8：设计用于最小化荧光团之间串扰的多波段发射滤光片的示例。请注意，由于CFP和TurboYFP之间的发射光谱重叠，第二通道中的串扰是不可避免的。
最小化群延迟色散（GDD）
使用飞秒脉冲激光进行激发的非线性光学（NLO）系统需要控制相移和群延迟色散（GDD）的光学元件。在这些仪器中，脉冲光束在最终到达样本之前，会透过或反射多个不同的光学组件。如果这些光学滤光片和镜子不是专为飞秒激光设计的，那么由于GDD的原因，每当脉冲串被反射或透射时，峰值脉冲强度就会降低（图9）。因为峰值脉冲强度的降低会减少NLO信号的数量，这种复合效应最终会导致仪器性能变差。
图9：说明群延迟色散（GDD）效果的图表。
分散控制型二向色滤光片和镜子能够同时控制激光的相位和振幅（图10），从而最小化色散并减少峰值脉冲强度的损失。
图10：一款设计用于在大波长范围内控制GDD的高反射率滤光片。
我们的荧光滤光片均采用创新的SIRRUS等离子体沉积工艺进行硬化镀膜。这一工艺使我们能够生产出具有陡峭边缘、通常大于95%的高透射率、精确波长控制、深度阻挡和低透射波前误差（TWE）的高性能激发、发射和二向色滤光片，并且还规定了零像素偏移。
我们的激光、成像、TIRF和超分辨率应用的二向色分束器能够在1.05 mm厚的基底上实现λ/2 P-V每英寸或更好的平整度水平，在更厚的基底上实现λ/10 P-V每英寸或更好的水平。我们还提供在宽波长范围内控制GDD的高反射率镜子和二向色滤光片。
无论您是在设计OEM荧光系统还是在市场上寻找滤光片立方体，我们知识渊博的工程师都将与您合作，设计出最符合您特定要求的荧光滤光片。
