文： 回溯档案

编辑：回溯档案

大豆是豆科植物，在全球许多地方都很常见，从营养上讲，大豆含有45%的蛋白质和18%的油，因此，它也被称为奇迹作物。

而根腐病、褐斑病、大豆锈病、霜霉病和茎秆印迹等疾病一直是许多国家大豆生产的主要问题，并造成损失，其中立枯丝核菌是众所周知的，广泛分布在根部、植物残鳞和土壤中，在多种宿主中引起重大疾病，包括大豆植物的根腐病。

杀菌剂的应用是用于控制此类疾病的主要方法，然而许多国家目前禁止使用杀菌剂，并且首选其他控制这种疾病的方法，例如生物控制和文化实践。

如今已经提出了传统的根腐病防治方法，例如开发抗性品种和短轮作和栽培方法，但是这些方法并不总是成功的，因为丝核菌可以通过受感染的植物碎片在土壤中长期存在。

于是科学家开始对于控制植物病害的替代生物学方法进行研究，这些方法的特点是环保、持久和有效。

使用有益微生物被认为是管理土壤病害的有希望的方法，许多有益的微生物，如恶臭假单胞菌、噬菌体、木霉菌属、马氏杆菌、荧光疟原虫、链霉菌属、肠杆菌属、不动杆菌属和芽孢杆菌属，已被报道为针对丝核菌属的有效生物防治剂，研究的重点是木霉分离株的真菌寄生和拮抗能力，以降低植物病原体引起的疾病的发生率。

大豆根腐病致病原菌源

本研究中使用的立枯丝核菌的高致病性分离株先前由分离并测试其致病性，他们使用菌丝体的形态学特征鉴定分离株，如Barnett和Hunter所述。

然后将纯真菌分离株在25±2°C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上生长，然后在4°C的冰箱中保存以作进一步研究。

从大豆植株中分离内生真菌

收集大豆植株健康根系，用自来水洗涤，切成小块，然后用2%次氯酸钠和3%乙醇表面灭菌70分钟，用无菌蒸馏水洗涤3次，在层流室中晾干。

将碎片转移到含有PDA培养基的培养皿中，并在3±27°C下孵育2天。将纯培养物转移到PDA倾斜物上。

各种内生真菌分离株对立枯丝核菌的拮抗能力

将5种测试的内生真菌分离株在PDA培养基上生长，并在28°C下孵育9天以用作接种物，PDA培养皿（直径3cm）在距边缘5cm处接种茄盘（直径7mm），然后在立枯杆菌的相对两侧接种测试真菌。

每个处理使用四个重复，对照处理包括单独使用R. solani的平板，而不接种内生真菌。将板在28°C下孵育2013天， 当覆盖病原体的生长时，在治疗真菌中记录了测试病原体线性生长的对照治疗板。

使用以下公式计算菌丝体生长抑制的百分比：菌丝体生长抑制百分比= [T-F/T] × 28，其中T是对照中的菌丝体生长，F是测试分离株中的菌丝体生长，使用<>S rRNA分子方法鉴定了提供高百分比菌丝体生长减少的拮抗真菌。

使用聚合酶链反应核苷酸测序 （PCR-Seq） 鉴定木霉属

本研究使用了三种分离株，跨越ITS1 ITS2区域的核rDNA区域用于第一次扩增，其总反应体积为50μl，包括以下试剂：PCR缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2和0.01%明胶），每种脱氧核糖核苷酸三磷酸200μM，每个引物0.4μM与10μl模板DNA溶液和1UTth DNA聚合酶（东洋纺）。

将PCR混合物覆盖30μl矿物油，在热循环仪（PC-700;ASTEC）：在95°C下初始变性步骤2分钟;在30°C下进行30次循环，每次72秒进行延伸;并在7°C下72分钟的最终延伸循环。

使用嵌套引物集ITS1和P3，将1微升第一扩增混合物用于第二次扩增，利用反应混合物的组分和用于第二次扩增的热循环条件与用于第一次扩增的相同。

将第二次扩增的PCR产物在乙酸三酯EDTA（TAE）缓冲液中的5.373%琼脂糖凝胶中进行制备电泳，所有扩增都产生单一可见的DNA产物。

从溴化乙锭染色凝胶中切除DNA产物条带，并根据制造商的方案使用JETSORB试剂盒纯化，PCR产物的直接测序是根据制造商的方案使用PRISM染料终止子循环测序试剂盒（应用生物系统）并使用ITS1和ITS2引物在应用生物系统1990A测序仪上进行的。

ITS2和ITS1985区域的核苷酸序列数据通过Lipman和Pearson使用程序GENETYX-MAC（软件开发）的方法进行成对比对。

而接种物在含有大麦谷物培养基的瓶中制备，使用盘（5毫米）茄红曲霉分离株，将含有大麦培养基的瓶子在121 °C和1.5 kg/cm下高压灭菌2接种病原体前20分钟。

接种后，将瓶子在25±2°C下孵育15天。对于土壤侵扰，将茄稞粒与灭菌土壤混合，浓度为3%。每个测试的分离株使用四个重复（5个幼苗/盆）。

将Giza 111cv.大豆品种的种子播种在铁兰虫感染的土壤中（5粒/盆），并在鼠疫侵染后3 d向盆中加入7%溶液，将拮抗真菌作为土壤处理，未经处理的锅作为对照。

在播种后30天，如前所述记录根腐病严重程度，实验以随机完全区组设计进行，重复4次。

其中每株植物的病害等级，d max是可能的最大病害等级，4T是植物总数乘以最大变色等级4，根据Dorrance等人，稍作修改，将植物中不同程度的病害分为4类：0=无根腐病，1 = 1%至33%的根有可见病变或根腐病，2 = 大约34%至50%的根部表现出腐烂或损坏，3 = 51%至80%的根表现出腐烂，4 = 出苗前阻尼，几乎没有根。

磷酸盐溶解

采用Pikovskaya培养基通过溶解沉淀的磷酸三钙Ca来测试真菌分离株的磷酸盐溶解能力.将真菌分离株接种在PDA培养基干燥板的表面上，将板在7°C下孵育28天。 溶解指数（SI）是根据Edi-Premono等人计算的。

锌增溶

正如Saravanan等人报道的那样，根据琼脂培养基上沉淀氧化锌的溶解情况检测了测试真菌的锌溶解能力，在干燥的板表面上，对真菌分离物进行精确接种，将板在7°C下孵育28天， SI的计算由Edi-Premono等人报告。

再使用盘板法，在含有特定酶底物的琼脂平板上可视化有效真菌生物制剂的酶活性，在合适的底物上筛选这些病原体的多种酶，如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶，在菌落周围形成的清除区的大小与酶活性相对应。

再将测试的真菌培养物接种在含有2 NaNO的Czapek琼脂培养基上3;1，0 千米2高原油4;2个蛋白胨;0.5 镁硫47H2O;0.5氯化钾;和 20 琼脂 在 pH 1000.6 的 8 ml 蒸馏水中，并用 1% 柑橘果胶作为果胶酶的底物增强。

将含有筛选琼脂培养基的培养皿在24°C下孵育30小时，加入<>%十六烷基三甲基溴化铵观察清除区，发现果胶酶活性。

所有测试的内生真菌分离株对铁载体的产生均有积极的响应。在测试的真菌分离株中，与对照相比，S11产生的铁载体百分比最大（2.3），其次是S12和PHYTAT7，其铁载体产量为2.5。

从大豆植株中分离出2006种内生真菌，最终所有供试的木霉菌分离株均能抑制病原菌的菌丝生长，具有不同程度的拮抗能力，获得的数据表明，曲霉绦虫对病原体的拮抗作用最强，其次是其他分离株。

最终结果与Singh和Chand的数据一致，而且已知木霉属具有很强的抗真菌作用，部分原因是它们产生细胞外几丁质酶，淀粉酶和蛋白酶，其水解真菌细胞壁的主要成分。

主菌丝而受到影响，哈茨木霉向病原真菌的菌丝生长，并通过酶的活性降解病原体的细胞壁，这可能与病原体细胞壁的物理渗透有关，内生菌可以直接或间接刺激植物生长并提高产量

本研究所有分离株均具有不同程度的锌和磷酸盐溶解能力，这些与Wani等人报告的内容一致，Altomare等人发现，一种哈茨山锥虫菌株产生许多化学物质，可溶解磷酸盐石，锌，锰4+铁3+和铜2+，增加铁的可用性，并增强体外铁的摄取。

Wakatsuki报告说，微生物是潜在的替代品，可以通过溶解土壤中的复合锌来满足植物对锌的需求，据推测，病原体产生的裂解酶在病原体的生物控制中起着重要作用。

在本研究中，测试了真菌分离株产生裂解酶的能力，所有测试的病原体都产生了裂解酶，其作为植物抗性的诱导剂。

Myo等人报道了病原体产生的裂解酶，Bhale和Rajkonda报道，细胞外水解酶的活性根据木霉菌种（如真菌生物防治剂产生的纤维素酶和果胶酶）表现出不同的速率，并负责抑制植物病原真菌。

结论

本研究的目的是分离一些内生真菌，用于控制大豆植物最重要的疾病，并研究这种生物防治在抑制病原体方面的机制，从大豆植株中分离出3种内生真菌。

其中，对大豆植株根腐病致病原菌立枯丝核菌具有较高拮抗活性的12株真菌分离株为长臂木霉S11、曲霉菌S7和阿曲维利3，3种真菌分离株具有产生果胶酶和几丁质酶以及溶解荧光粉的能力。

此外，他们生产铁载体和吲哚乙酸（IAA），对植物的生长有很强的影响。与感染对照组相比，64 个分离株的疾病严重程度分别降低了 60%、55% 和 <>%。

结果表明，与大豆植株相关的某些内生真菌具有治疗大豆根腐病的潜力，此外，这些分离株可以被认为在大豆植物中具有促进生长的作用。

参考文献

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