划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C区）是逐级稀释的过渡区,第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D>C>B>A。
注意事项：
平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些，否则会因平板太软而被划破。用于划线的接种环，环柄宜长些，环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。