本文来源：中华内分泌代谢杂志, 2024,40(1) : 73-76. 本文作者：姚金玉 卢庆苗 鲁一兵 在过去的几年里，甲状腺疾病和继发性甲状腺功能减退症的发生率一直在增加。为了维持足够的甲状腺激素水平，患者需要在其余生中每日补充左旋甲状腺素，这将影响患者的生活质量。为使患者获得更好的治疗，需要不断探索、研发相关药物。传统的平面培养虽然简单可控，但是在培养皿中缺乏营养梯度、细胞分布均匀，不能准确地模拟细胞和组织的体内生长模式，无法对细胞极性和细胞之间的相互作用进行研究。三维培养涉及人工创建的生长环境，其中细胞可以进行三个维度上的相互作用，更能代表体内真实的细胞状态。类器官是原代组织或干细胞在体外进行三维培养后形成的细胞聚集体，其多种类型的细胞可以通过自组织和自更新形成类似来源组织或器官的复杂结构，模拟其生理功能。从2009年Sato等对小鼠干细胞进行三维培养，首次实现在体外产生具有隐窝样结构的肠道类器官开始，类器官相关研究在生物医学领域不断受到重视。近年来，甲状腺类器官技术的发展为研究甲状腺生长发育调控、再生医学、药物筛选和相关疾病的细胞治疗提供了极大的可能性。本文概括了甲状腺的发育机制，探讨甲状腺类器官潜在的应用领域，回顾总结甲状腺类器官构建的相关研究。 一、甲状腺发育机制 甲状腺的实质主要包含滤泡细胞(也称为甲状腺细胞)和滤泡旁细胞(也称为C细胞)。滤泡细胞起源于上皮，形成单层，其顶面朝向充满胶体的管腔，而其基底膜位于滤泡外空间。滤泡旁细胞为神经内分泌起源，位于滤泡细胞之间。这些C细胞负责产生降钙素(一种参与钙调节的激素)。除了上述2种细胞类型外，甲状腺还含有运输碘和激素所需的广泛血管系统，以及在滤泡组织周围形成隔膜的基质细胞。巨噬细胞和肥大细胞也存在于间质中，目前有证据表明三碘甲状腺原氨酸(thyroid hormones triiodothyronine, T3)参与巨噬细胞和肥大细胞的活化，关于这些细胞在甲状腺中的作用还需要更多的研究。在胚胎发育过程中，甲状腺的发育依赖于几个关键基因的共同表达，这些基因共同启动内胚层细胞向甲状腺特异性谱系定型。转录因子同源框蛋白(transcription factors homeobox protein, Nkx2.1，也称为甲状腺转录因子1)、配对框蛋白(paired box protein, Pax8)、叉头框蛋白E1(forkhead box protein E1, FoxE1，也称为甲状腺转录因子2)和发散同源基因HEX(HHEX)协同表达诱导复杂的信号级联，启动甲状腺发育。在器官形成的最后阶段，滤泡细胞排列到其永久位置，参与甲状腺激素合成的甲状腺特异性基因表达如促甲状腺素受体(thyrotropin receptor, TSH receptor, TSHR)、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase, TPO)、钠碘同向转运体(Na/I symporter, NIS)和甲状腺球蛋白(thyroglobulin, Tg)，随后滤泡细胞产生甲状腺素(thyroxine, T4)。在小鼠和人甲状腺类器官中，Pax8、Nkx2.1是2种充分表征的转录因子，存在功能性相互作用，两者都不是仅在甲状腺中表达，然而两者共表达是甲状腺所特有的，其作用是协同激活TPO、Tg和NIS基因启动子的转录。 二、甲状腺类器官的应用 类器官在甲状腺发育和疾病模型的建立中具有极高的应用潜力。类器官为研究甲状腺发育提供了三维模型，弥补了其他生物模型的不足。首先是忠实地代表亲代肿瘤生物学的体外模型，例如罕见的未分化甲状腺癌等恶性肿瘤，肿瘤类器官对原发性肿瘤患者特异性特征的再现有助于克服现有模型的局限性；其次，甲状腺类器官模型系统还可以用于学习其他有价值的甲状腺疾病包括自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid diseases, AITDs)、甲状腺功能减退及甲状腺功能亢进。van der Vaart等在2021年建立三维(3D)器官状甲状腺组织代表小鼠和人类甲状腺滤泡细胞(thyroid follicular cells, TFCs)，结果显示人甲状腺滤泡细胞类器官(TFC organoids, TFCOs)对一组Graves病患者的血清具有临床相关反应(增殖和激素分泌增加)，证明了类器官可以模拟人自身免疫性疾病。最后，再生治疗甲状腺功能减退一个长期的目标—恢复患者的甲状腺激素的生物合成，目前基于干细胞再生医学技术的发展已成为现实。 三、甲状腺类器官培养 1．多能干细胞来源的甲状腺类器官培养： 多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)，在器官再生与修复及疾病治疗等方面具有较高的应用价值。目前主要采用逐步诱导分化方案诱导多能干细胞进行甲状腺类器官培养。多能干细胞来源的甲状腺类器官培养方案有很多早期探索，其中一些研究影响力较大，使用的方案至今仍被沿用，其中包括Antonica等在2012年开发的可在体外生成甲状腺类器官的方法—顺序Dox-rhTSH处理方案。以多西环素(doxycycline, Dox)进行Nkx2.1和Pax8的诱导，使用重组人促甲状腺素(recombinant human TSH, rhTSH)促使细胞发育为滤泡样培养物。分化效率若以Nkx2.1＋/Pax8＋细胞的百分比量化可达到(60.5±8.1)%。在滤泡中可检测到上述甲状腺特异基因的表达，包括TSHR、NIS和Tg，滤泡腔室内存在碘化Tg(Tg-I)。将所得滤泡移植到甲状腺功能减退的小鼠肾囊下，可以使宿主小鼠血浆T4水平恢复正常，血浆TSH水平进行性降低，体温正常化。同年，Longmire等发现成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)2与生长分化因子Wnt 3a、FGF10、角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor, KGF)、BMP、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和肝素组合(简称WFKBE＋F2/H)，可以用于生成Nkx2.l＋细胞。Nkx2.l＋细胞以3D结构铺板于含有TSH的基质胶中，则可以诱导甲状腺类器官的发育。随后，在2013年，Ma等先后培养小鼠和人的用Pax8基因、Nkx2.1基因共同转染胚胎干细胞获得的Pax8＋/Nkx2.1＋细胞，均获得了在基底外侧面表达NIS，在胞质内和管腔内表达Tg的滤泡样结构。在Antonica等和Longmire等研究的基础上，Kurmann等在2015年使用小鼠PSCs进行诱导分化，在3D Matrigel条件下培养纯化的Nkx2.1＋细胞，所得类器官具有甲状腺滤泡典型的3D结构和分子表型以及有机化碘和产生少量T4的能力，并且可以在适当培养条件下进一步传代和维持至少52 d。移植后可以在宿主内提供甲状腺激素的功能性分泌。基于前人早期开发的基础培养方案和后续研究者对培养条件的不断探索，多能干细胞来源的甲状腺类器官的培养方案日趋成熟，目前通过将激素混合物添加到3D培养物中能够得到具有摄取碘和合成甲状腺球蛋白功能的甲状腺类器官，将这些类器官移植到甲状腺功能减退症小鼠模型中，可以得到正常的甲状腺样组织。 2．胚胎甲状腺组织来源的类器官： 关于胚胎组织来源的甲状腺类器官的研究目前较少，较为成熟的是Liang等在2022年的研究，阐述了从妊娠12周到16周异质性甲状腺细胞群演变的细胞图谱和潜在的调控信号，并且建立了一个长期培养的人胎儿甲状腺类器官系统(human fetal thyroid organoids system, hFTOs)。该系统保留了胎儿甲状腺谱系和分子特征，并且具有向小鼠体内移植后产生功能性人甲状腺滤泡的能力。研究者首先证实了hFTOs成熟通过环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)信号与胎儿滤泡细胞发育的相似性。然后分离供体胎儿的甲状腺并包埋在含有指定培养基的Matrigel中，测试其中成分的重要性，据此保留甲状腺类器官初级生长必需的类器官发育信号通路激活剂R-spondin 1、EGF、FGF10和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)抑制剂A83-01的头蛋白，最终获得的培养基有效地维持了hFTOs的生长，并且此类器官可以传代超过3个月而没有形态学变化。在结构上，hFTOs显示单层滤泡上皮结构，类似于原始腺体结构，可以观察到由单层滤泡细胞形成的腔，以及由Tg构成的腔内胶体成分。在功能上，hFTOs具有响应TSH刺激产生T4的能力，并且在长期培养中显示出生长和增殖能力，至少传代6次后，集落形成率无显著变化，且可维持Nkx2.1＋/Pax8＋细胞。在随后进行的移植实验中，甲状腺类器官移植到NSG小鼠的肾被膜下7周后成功整合到宿主生态位中，在移植部位发育为成熟甲状腺滤泡，且具有激素分泌功能和增殖能力。 3．成体甲状腺组织来源的类器官培养： 小鼠/大鼠和人甲状腺源性细胞被培养为能够自我更新的器官样细胞，并表达增殖和假定的干细胞和甲状腺特征，而甲状腺肿瘤相关基因的表达没有变化。早在1966年，Mallette等发现了成年大鼠的甲状腺细胞具有重新聚集和重建功能性甲状腺组织的能力，并且不受培养条件类型的影响。Mauchamp等在1979年培养成年猪甲状腺细胞获得了类似甲状腺滤泡的结构。1990年，Toda等报告了第1个在体外培养系统中重建甲状腺滤泡的实例。随后在1994年，Valentine等证明了甲状腺滤泡的形成不依赖TSH。2009年，Arauchi等首次证实了工程化甲状腺组织可以修复大鼠甲状腺功能减退模型。将来自大鼠的甲状腺细胞制成细胞片后移植到甲状腺功能减退大鼠体内，使大鼠的甲状腺激素水平改善并维持了4周。Khoruzhenko等在2021年证明了大鼠甲状腺细胞在Matrigel中培养的方法可以保持体外甲状腺滤泡的结构完整性和功能活性。研究者分离未损伤的大鼠甲状腺滤泡，使用尼龙网进行双重过滤纯化并收集后包埋于基质胶中培养2周，生成了表达Tg、T4和闭锁小带-1(ZO-1)并且具有有机化碘能力的滤泡结构。同年，Ogundipe等开发了体外3D培养系统，并且培养出了具有潜在干细胞特征的细胞亚群的甲状腺类器官。将来源于小鼠和人甲状腺组织的甲状腺细胞接种在Matrigel中，然后在甲状腺成熟培养基中培养，使其形成含Tg填充的胶体滤泡样结构。将分散的鼠和人甲状腺类器官来源的细胞移植到甲状腺功能减退小鼠模型的肾包膜下，8周后，鼠甲状腺细胞形成表达Nkx2.1(56%±2.6%)、Tg(35%±1.5%)和T4(10%±0.3%)的滤泡结构；类似地，26周后，人甲状腺细胞形成表达Nkx2.1(76%±4.1%)、Tg(20%±2.0%)和T4(24%±1.5%)的滤泡结构，在移植后29周保持稳定。这些结果证明了原代甲状腺来源的细胞可以自我更新成类器官，并在体外和体内成熟为产生游离T4的功能性甲状腺滤泡。 4．肿瘤组织来源的甲状腺类器官培养： 甲状腺肿瘤是一种异质性疾病，患者的临床表现和预后各不相同。近年来，研究者们对肿瘤组织来源的甲状腺类器官的培养进行了不断的探索。其中较为经典的包括Sondorp等在2020年开发的一种患者来源的乳头状甲状腺癌类器官模型，其对放射性碘的反应性明显类似于起源肿瘤。将不同患者来源的甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer, PTC)组织和属于放射性碘难治性疾病(radioactive iodine-refractory disease, RAIRD)的甲状腺癌组织解离成单细胞和细胞团块后进行3D培养，以生成PTC类器官和RAIRD类器官。PTC类器官可以至少传代5次，其中稳定的类器官形成效率(organoid-forming efficiency, OFE)约为7%，并显示肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)的存在；RAIRD类器官可以传代至少3次，其中OFE约为5%，且显示出与PTC类器官的明显差异。免疫荧光染色显示PTC组织、PTC类器官、RAIRD类器官3者的Nkx2.1、Pax8、Tg和原癌基因c-MET的基因表达水平相似，主要差异是在RAIRD类器官中完全不存在NIS表达。此外，与RAIRD组织中Tg位于间质空间中不同，RAIRD类器官中Tg位于滤泡腔内。随后2022年，Pecce等描述了无需在培养基中使用合成补充剂的方案。研究者利用癌细胞自然释放的信号分子，建立了从相同细胞混合物中产生的原代培养物，然后用原代培养产生的条件培养基来补充生长类器官系，建立了4个甲状腺类器官系，1个来自健康细胞(N系)，3个来源于甲状腺癌细胞(T系)：OrgN 1来源于正常甲状腺组织；OrgT 1来源于乳头状甲状腺癌(PTC)；OrgT 2来源于PTC的淋巴结转移；OrgT 3源自未分化甲状腺癌(ATC)，4个类器官系培养4～10个月。使用Sanger测序法针对甲状腺癌驱动基因BRAF、N-K-H-RAS、PTEN、TP53中热点突变检测，在3个癌细胞系类器官中发现与其起源组织相同的突变。OrgT l系细胞生长速率较低，生长至4个月，对于BRAF基因的p.V600E突变仍然呈阳性，寿命比其他类器官系短。OrgT 2系细胞生长速率高，在建立8个月后，在BRAF基因中具有低频p.V600E突变(3%)。OrgT 3系以100%的等位基因频率显示PTEN基因中的p.R130X突变和TP 53基因中的p.R273C突变，即使长期培养达10个月仍保留其来源组织的遗传和表型特征。Chen等在不存在指定化合物的情况下培养患者来源的PTC细胞10 d，通过观察形成的类器官的数量和大小找到建立PTC类器官系的最低要求。最终发现在基质胶中添加EGF和SB 202190足以用于人PTC类器官的形成和生长，成功率为71.4%。在此基础上，建立了9个PTC类器官模型，其中5个具有BRAF V600E突变。这些类器官的组织病理学特征、分子标志、遗传特征和突变特征与在匹配的患者肿瘤中检测到的一致，而且可稳定培养超过3个月而不显示出任何生长速率的降低和形态的显著变化。HE染色和免疫荧光分析显示PTC类器官概括了其相应的亲本肿瘤的形态学和组织学特征，WES显示建立的PTC类器官还捕获了原发性肿瘤的BRAF V600E突变。使用肿瘤亚型标志物的抗体进行的免疫荧光分析显示CK 19和半乳糖凝集素-3这2种标志物在不同PTC类器官之间的表达差异与亲本肿瘤一致。此外，PTC类器官的药物敏感性测定证明了患者特异性药物反应，如具有BRAF野生型的其他品系对BRAF V600 E抑制剂维罗非尼和达拉非尼敏感。以上这些结果表明患者来源的肿瘤类器官可以概括亲本组织的体内结构、功能和遗传特征，较好地反映了起源肿瘤的瘤内突变异质性。 四、结语 类器官技术可以更好地了解甲状腺组织的细胞和分子生物学以及甲状腺组织的发病和肿瘤发生机制。尽管存在种种限制，但令人兴奋的类器官技术为研究人员提供了广泛的应用前景，可以更准确地模拟健康和疾病中的甲状腺，并提供一个优秀的临床前体外平台。迄今为止，已经从ESCs/iPSCs、胚胎来源甲状腺组织、成体甲状腺组织和甲状腺癌组织重建和产生了类器官，这些类器官可用于各种目的，例如了解甲状腺组织的形态学、组织学和生理学特征以及甲状腺再生治疗。类器官培养技术可用于了解甲状腺肿瘤的发生机制、抗癌药物筛选、个体化用药、再生治疗甲状腺功能减退等，从而获得更有效的治疗方法。 五、展望 目前，在培养方面，类器官培养的2个重要方面使得该技术非常适合于后续研究。首先，类器官可以扩增同时保持遗传稳定性；其次，接受甲状腺癌治疗的个体的原代细胞库可通过低温储存含有特定干细胞的类器官来生成，如骨髓和脂肪组织等。在应用方面，用TSH体外处理含有特定干/祖细胞的甲状腺源性细胞或对移植了甲状腺细胞的甲状腺功能减退小鼠给予TSH可加速滤泡生成。移植的进一步优化可以通过增加移植的细胞数量和提前血管化类器官以增强组织再生和减少移植所需的时间来实现。虽然目前尚无甲状腺类器官生产的标准方案，在使用不同的生长因子、激素、培养条件和持续时间方面仍有争议，相关实验系统也未完全开发，毫无疑问的是，通过尝试将血管网络、结构化基质、生物反应器等进行组合，下一代甲状腺类器官培养会更接近临床实践。 本文编辑：周丽斌