髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）是婴幼儿和青少年最常见的恶性脑肿瘤，它起源于小脑发育期间存在的祖细胞群。髓母细胞瘤标准治疗包括手术、化疗和放疗，这大大提高了患者的生存率。但仍有25%-30%的高危MB患者会出现肿瘤复发。随着基因组学和分子生物学研究的不断进展，髓母细胞瘤可分为四种主要的分子亚型，包括WNT型、SHH型、Group3型（G3型）和Group4型（G4型）。每个亚型都具有独特的转录谱和肿瘤驱动突变，预后也不尽相同。

在肿瘤中，CD8+T细胞与MHC-I类分子，以及CD4+T细胞与MHC-II类分子的相互作用是建立肿瘤特异性T细胞反应和有效免疫治疗的关键。引起T细胞激活的肽被称为抗原。传统的抗肿瘤免疫疗法针对的是肿瘤相关抗原（TAAs），是在肿瘤细胞中异常过度表达的自身抗原。新近研究更关注新抗原（neoantigens）和新表位（neoepitopes），因为它们不受宿主免疫耐受的影响，对于免疫系统来说是全新的，因此靶向肿瘤特异性突变具有吸引力。

虽然针对肿瘤驱动突变的治疗更具吸引力，但无论是何种抗原，均可能作为免疫靶点有效地杀死肿瘤细胞。此外，由基因融合产生的肿瘤特异性抗原也是一种新抗原，有可能引发强烈的免疫反应。因此对肿瘤抗原谱系的开发利用可能为免疫治疗提供有效的靶点，尤其是对于髓母细胞瘤这种突变负荷低但具有高度异质性的肿瘤。

在本文中，来自美国佛罗里达大学的作者团队开发了一种名为开放阅读框抗原分析（O.R.A.N）的系统，对国际癌症基因组联盟（ICGC）和欧洲基因组-表型档案（EGA）中170例髓母细胞瘤的数据进行分析。通过计算机分析，利用基因表达数据来识别不同类型的抗原（图1A）。目前该领域的抗原预测系统主要识别新抗原以及更常见的与CD8+T细胞相关的MHC-I相关抗原。O.R.A.N在此基础上进一步发展，从包括新抗原、肿瘤相关抗原和融合蛋白等多种类别中计算 MHC-I和MHC-II限制性抗原。本研究的主要目标是确定（1）髓母细胞瘤各个亚型中不同类别抗原（如新抗原、肿瘤相关抗原和融合蛋白）的预测数量；（2）在指定的髓母细胞瘤亚型中相同抗原重复出现的情况；（3）所有髓母细胞瘤亚型中相同抗原重复出现的情况。该研究对于确定髓母细胞瘤个体化或共有的以抗原为导向的免疫治疗策略至关重要，同时更好地勾勒出髓母细胞瘤的免疫图谱。

01

髓母细胞瘤中的突变负荷

和假设的肿瘤相关基因

研究者发现，髓母细胞瘤的突变负荷较低（图1B-E），单核苷酸变异（SNVs）占突变的大多数，插入缺失和基因融合数量相似。各亚型的平均突变数为：WNT型：20.9，SHH型：19.7，G3型：11.8，G4型：13.3。G3和G4型SNVs数量显著降低。每个肿瘤平均存在15个突变（0-155），2个插入缺失和2.5个基因融合，各亚型无统计学差异。

对肿瘤相关基因（TAGs）的研究显示，各亚型的平均TAGs数为：WNT型：6个，SHH型：4.3个，G3型：9个，G4型：8.7个。G3和G4型多于WNT型和SHH型。G3型和WNT型显著高于SHH型。

图1：B：髓母细胞瘤（MB）各个分子亚型的单核苷酸变异（SNVs）情况；C：各个亚型小插入和缺失的情况；D：各个亚型的蛋白质编码融合计数；E：各个亚型的肿瘤相关基因（TAG）数目。总样本量：170，WNT型：18，SHH型：46，G3型：41，G4型：65。

02

肿瘤特异性突变的免疫原性及新抗原预测

正如上文所示，单核苷酸变异SNVs构成预测的新抗原的大部分，但并非所有已识别的SNVs都具有免疫原性。总体来看，各亚型中MHC-I限制性新抗原平均数量为：WNT型：2.6，SHH型：3.2，G3型：1.6，G4型：1.6（图2A-B）。MHC-II限制性新抗原平均数量为：WNT型：3.5，SHH型：4，G3型：2，G4型：2.2（图2C-D）。G4型肿瘤预测的新抗原数量显著低于WNT型和SHH型肿瘤。G3型肿瘤预测的新抗原数量显著低于SHH型肿瘤。

另外研究者还评估了各个亚组中新抗原的表达情况（表1，略）。所有WNT（100%）肿瘤和大多数G3型（87.8%）和SHH型（84.8%）肿瘤至少表达一种新抗原，但只有64.6%的G4型肿瘤至少表达一种新抗原。约77.8%的WNT型和56.5%的SHH型肿瘤表达三种或更多的新抗原，而G3型和G4型肿瘤中只有29.3%和35.4%表达三种或更多的新抗原。总之G3型和G4型肿瘤的新抗原数量比WNT和SHH型肿瘤少。另外从所有肿瘤中鉴定出的 3018个突变（SNV和插入/缺失）中，仅有390个具有免疫原性（12.9%），这表明并非所有可鉴别的突变都具有免疫原性。

图2：MB中MHC-I/II类限制性新抗原。A：各个亚型MHC-I类限制性新抗原；B：MHC-I类限制性新抗原按变异类型分组；C：各个亚型MHC-II类限制性新抗原；B：MHC-II类限制性新抗原按变异类型分组。

有趣的是，基因融合具有高度的免疫原性，在肿瘤中发现的大多数已鉴别的融合对MHC-I和II类分子的结合力也很高（图2E-F，略）。在所有肿瘤中鉴定出的108个融合中，共有75个具有免疫原性（69%），提示基因融合比新抗原更具有免疫原性。

03

肿瘤相关抗原的预测

肿瘤相关抗原（TAAs）是一种在肿瘤中高表达但在正常组织中低表达或几乎不表达的抗原。分析显示TAAs 与肿瘤-睾丸抗原（CTA）或发育性抗原有着紧密的联系，后者在肿瘤的发生和发展中至关重要。研究者通过O.R.A.N从已鉴别的肿瘤相关基因预测具有免疫原性的肿瘤相关抗原。

总体来看，G3型和G4型肿瘤表达的肿瘤相关性抗原较多（图3 A-B），无论是MHC-I或MHC-II限制性抗原均是如此。各个亚型的平均MHC-I限制性TAA数量为：WNT型：5.3个，SHH型：3.5个，G3型：5.3个，G4型：5.6个。SHH型的免疫原性TAAs数量显著降低。各个亚型的平均MHC-II限制性TAA数量为：WNT型：4.8个，SHH型：2.6个，G3型：5.7个，G4型：5.3个。在各个亚型中，免疫原性TAAs的表达情况为：所有WNT（100%）肿瘤以及大多数G3型（97.6%）和G4型（98.5%）肿瘤至少表达一种TAAs，但只有60.9%的SHH型肿瘤至少表达一种免疫原性TAAs（表2，略）。有88.9%的WNT型、80.5%的G3型和67.7%的G4型肿瘤表达三种及以上的TAAs，而SHH型仅有34.8%。

对肿瘤相关抗原与胎儿小脑组织和成人睾丸组织表达进行无监督聚类分析，以表征肿瘤与这些组织共有的抗原（图3 C，略）。分析显示肿瘤相关抗原被分为三类，第一类包括基因IMPG2，它在 WNT 型、G3型和G4型肿瘤中高表达。第二类包括免疫原性TAA，这些抗原在睾丸中也有上调，因此也被视为CTA。然而，该组中并非所有的TAA都被鉴定为CTA。第三类包括单一的胎儿抗原NEUROG1，它在胎儿小脑中过表达，存在于WNT型、G3型和G4型肿瘤中。NEUROG1是菱唇侧脑室下区（rhombic lip subventricular zone）已知的标志性基因，在 G4型肿瘤的形成中发挥着基础性作用（图3 D-F，略）。

图3：A-B：各个亚型肿瘤相关抗原的表达情况

04

各个亚型内重复出现的抗原

为了确定MB中最常表达的抗原是哪些，以及这些抗原出现的频率，研究者分析了每个亚型中重复出现的抗原图谱。至少出现在2个肿瘤中的抗原被定义为重复出现的抗原。在WNT型肿瘤（n=18）中，重复重现的抗原共19种，其中TAAs共14种，包括NEUROG1、IMPG2、NPS、LRIT1和C7orf62。值得注意的是，CTNNB1是驱动WNT型肿瘤的关键突变之一，是这些肿瘤中唯一高表达的新抗原（图4A，略）。WNT型肿瘤显著富集的通路是神经嵴分化相关通路（图4B，略）。在SHH型肿瘤（n=46）中，重复出现的抗原共40种，其中TAAs24种，突变14种，基因融合产生的2种（图4C，略）。主要的新抗原包括DDX3X、PRKAR1A和PTCH1等基因，这些基因通常与肿瘤进展有关。而TAAs包括ZNF492、AC006486.9、TGIF2LX、PIK3R3和XKR5等。近20%的肿瘤存在由SPSB4-PXYLP1融合蛋白产生的融合抗原。值得注意的是有一组患者肿瘤表达的抗原较少，并缺少重复的TAA表达。SHH型肿瘤显著富集的通路是肿瘤中心碳代谢通路（图4D，略）。

在G3型肿瘤（n=41）中，重复出现的抗原共33种，29种为TAA（图4E，略）。其中 NEUROG1和IMPG2在超过 90%的肿瘤中表达，其他值得关注的TAA包括MAGE家族蛋白及ZNF679、ZNF492、C7orf33和PIK3R3等。4种为新抗原，包括SMARCA4、TRAPPC5。G3型肿瘤显著富集的通路是组蛋白去乙酰化酶结合和调节干细胞多能性通路（图4F，略）。与G3型类似，G4型肿瘤（n=65）也高度表达TAAs，在所有重复出现的50种抗原中有43种为TAA（图4G，略）。NEUROG1在G4型肿瘤中的表达率达到100%，提示其作为免疫治疗潜在的靶点。其他反复出现的肿瘤相关抗原包括ZNF679、IMPG2、HIST1H1A、ZNF492和OTOR等。新抗原出现数量较少。G4型肿瘤显著富集的通路包括组蛋白去乙酰化酶结合通路以及单纯疱疹病毒1型感染相关通路（图4H，略）。总体来看，各亚型中大多数重复出现的抗原为肿瘤相关抗原，只有SHH型中新抗原较多。

在抗原负荷与预后的关系方面，在G4型肿瘤中，MHC-I/II限制性SNVs与PFS之间存在中等程度的相关性，相关系数分别为0.64和0.52。在G3型肿瘤中，MHC-I/II限制性TAAs与OS之间存在强相关性，相关系数分别为0.79和0.77。与PFS也存在强相关性，相关系数分别为0.97和0.97。

05

髓母细胞瘤中重复出现的抗原

研究者对髓母细胞瘤（n=170）所有亚型中同时存在的抗原进行了评估，以确定有望适用于所有患者的单一免疫疗法的可行性。在至少两例肿瘤中表达的抗原被定义为共享抗原。共有18种新抗原被至少两个亚型肿瘤共享，但仅有一种新抗原被所有亚型共享（图5A）。DDX3X是最常见的共享新抗原（12%），但仅在WNT和SHH肿瘤中表达。SMARCA4是第二常出现的共享新抗原（6%），在所有亚型中均有表达（图5C）。DDX3X在WNT和SHH肿瘤中表达，涉及肿瘤的生存、生长和恶性潜能。SMARCA4与遗传和表观遗传网络有关。其他常见的共享新抗原包括ZMYM3、ZIC1、TP53、ANGEL2、PTEN和KMT2D等。

在各个亚型之间，肿瘤相关抗原（TAAs）的共享现象更加普遍，其中至少有两个亚型共享47种TAA，三个亚型共享10种TAA，所有四个亚型共享8种TAA（图5B）。G3型和G4型肿瘤共享的TAA数量最多（共30种）。在所有亚型之间共享的TAA包括NEUROG1、AC006486.9（新蛋白质）、NPS、OTOR、ZNF679、RP11.603J24.9（AC034102.2，新蛋白质）、ZNF492和LRIT1（图5D，略）。

图5：A-B：各个亚型新抗原和TAA的共享情况；C：各个亚型间共享抗原的具体表达情况。

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抗原呈递

为了评估髓母细胞瘤是否能有效呈递假设的抗原，研究者通过微阵列技术分析了已发表的763例髓母细胞瘤基因表达谱的数据集，分析这些肿瘤中参与抗原加工和呈递途径的基因表达。与其他亚型相比，G3型髓母细胞瘤中的抗原加工和呈递途径显著下调（图6A，略）。基因的无监督聚类分析显示，G3型髓母细胞瘤通过下调MHC-II的表达关闭抗原呈递途径（图6A，略）。在其他亚型中，抗原加工和呈递途径没有显著变化。然而，G4型肿瘤（绿色柱状图）中涉及MHC-I表达的基因下调。MHC-I的下调作为一种潜在的免疫逃避机制，此前已在髓母细胞瘤中得到证实。

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髓母细胞瘤的免疫学特征

无监督聚类分析显示，免疫细胞按照髓母细胞瘤的分子亚型聚类（图6B，略）。与G3型和G4型相比，WNT和SHH型肿瘤中存在更多髓源性免疫细胞，如树突状细胞、单核细胞及B细胞上调（图6B-C），与既往研究一致。相较于其他免疫细胞，调节性T细胞（Treg）在所有髓母细胞瘤亚型中高度富集，在WNT和SHH肿瘤中的富集程度更高。相比之下，G3型淋巴源性CD4辅助T细胞水平更高，G4型与其他亚型相比没有特定的免疫细胞水平增高。在任何亚型中均未检测到CD8记忆T细胞。另外肿瘤相关抗原TAA而非新抗原与免疫学评分存在强相关性。

图6 C：各个亚型免疫细胞的浸润评分，调节性T细胞（Treg）在所有髓母细胞瘤亚型中高度富集

08

讨论和结论

髓母细胞瘤患者迫切需要更安全，更个体化的治疗方案。但髓母细胞瘤具有突变负荷低和抗原表达的异质性，可导致免疫抵抗和逃逸。为了解决抗原的异质性问题，正在开发具有多种抗原特异性T细胞群体的治疗策略。以抗原为导向的免疫治疗需要考虑的一个重要问题是识别与肿瘤HLA分子具有强结合力的免疫原性抗原。因此本研究开发了一种名为O.R.A.N的抗原预测方法，能够预测多种类别的抗原，如新抗原、肿瘤相关抗原和融合抗原。

本研究从髓母细胞瘤中鉴别出的3018个非同义突变中，仅预测到了390个免疫原性突变，这说明髓母细胞瘤突变的免疫原性较差。在所有170个患者的肿瘤中，有79.4%至少存在一种新抗原，这说明大多数，但并非所有患者都能从基于新抗原的免疫治疗中获益。但仅有44%的肿瘤表达3种或以上的新抗原，说明基于新抗原的治疗可能不足以起效。而肿瘤相关抗原的出现率高，而且在确定的166种肿瘤相关基因中，143种预测具有免疫原性，表明肿瘤相关基因具有高度的免疫原性。此外至少88.2%的患者含有一种TAA，64%的患者表达超过3种TAA。因此TAAs有望成为有价值的标志物，靶向泛TAA可能作用于所有肿瘤细胞，并解决肿瘤内抗原异质性的挑战。在预后最差的G3型肿瘤中，MHC-I/II TAAs与PFS和OS之间存在显著的相关性，这强调了TAAs作为评价此类肿瘤预后的潜力。

本研究预测大多数髓母细胞瘤具有独特的抗原，在不同亚型中发现的重复出现的抗原，针对如CTNNB1、DDX3X和SMARCA4等肿瘤驱动突变的新抗原以及诸如NEUROG1和PIK3R3等可能在肿瘤进展中发挥作用的肿瘤相关抗原（TAAs）开发新的免疫疗法是很有吸引力的。由本文作者所在中心开展的临床前和临床研究如ReMATCH（NCT01326104）和ACTION（NCT03334305）等，都利用肿瘤RNA作为抗原的来源。临床前研究已经成功生成抗肿瘤T细胞，为肿瘤宿主带来生存获益。其他研究同样在临床前模型中证明了针对髓母细胞瘤或儿童高级别胶质瘤的疫苗或抗原特异性T细胞的抗肿瘤反应。此外，肿瘤疫苗能够与其他免疫疗法协同作用，增强其疗效。使用O.R.A.N流程预测的抗原可以用于开发髓母细胞瘤的抗原特异性免疫疗法，并可以通过解决肿瘤异质性和免疫逃逸来改善患者预后。

参考文献：Changlin Yang, Vrunda Trivedi, et al. Identifcation of tumor rejection antigens and the immunologic landscape of medulloblastoma. Genome Medicine (2024) 16:102.

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