作者：陈嵩 吕宁 赵明

单位：中山大学肿瘤防治中心

编者按

肝细胞癌（以下简称肝癌）是一种恶性程度极高的原发性肝脏肿瘤，超70%患者在初诊时已进入不可手术切除的中晚期阶段。既往索拉非尼和仑伐替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）为晚期肝癌主要治疗方案，近年来，以抗PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抑制剂（ICI）及以其为基础的联合治疗方案在肝癌治疗领域取得突破，显著提升了患者生存，逐渐成为指南推荐的首选治疗方案。然而，单药ICI治疗的有效率不超过20%，通过联合抗血管生成药或TKI可有效提升疗效，但仍不超过40%，提示部分患者无法从免疫治疗中获益。因此，亟需探索能够预测临床疗效和预后的生物标志物（biomarker），筛选适合免疫治疗的人群，避免延误治疗时机和增加非必要毒性，最大程度提高疗效。本刊特邀请中山大学肿瘤防治中心赵明教授就近年来肝癌免疫治疗相关生物标志物的研究进展进行了综述。

传统免疫治疗疗效预测的生物标志物主要指肿瘤微环境中PD-L1的表达水平，其中包括肿瘤细胞和免疫细胞的PD-L1表达，以及肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI），这三个指标广泛应用于肺癌、肠癌和黑色素瘤等多种肿瘤免疫治疗疗效预测标志物，在肝癌免疫治疗疗效预测方面也得到了大量的探索。

01

肿瘤微环境中PD-L1的表达

PD-L1表达的评估受到检测所用抗体的克隆多样性、肿瘤和浸润细胞的不同评分方法以及取样组织的生物异质性的挑战。肝癌由于具有富含免疫细胞的肝硬化微环境，进一步增加了PD-L1表达状态的复杂性。目前研究表明，PD-L1在HCC中的表达较低，且在应用不同PD-L1染色抗体时（22C3、28-8、SP142、SP263和EIL3N）呈异质性。

既往多项临床研究探索了PD-L1是否可用于预测肝癌免疫治疗疗效的生物标志物，Keynote 224研究报道了帕博利珠单抗二线治疗晚期肝癌的临床疗效，随后分析了肿瘤组织内基线PD-L1表达与治疗疗效之间的相关性，结果发现：肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞上的PD-L1表达与反应相关，单一肿瘤细胞PD-L1表达与缓解无关[1]，CheckMate 040研究证实了这一观点，即基线肿瘤PD-L1表达水平高低与治疗缓解之间无相关性[2]。然而，在CheckMate 459和GO30140研究中分析发现，PD-L1的表达与治疗疗效以及患者预后显著相关，肿瘤内PD-L1表达水平越高，免疫治疗缓解率越高，患者长期预后越好[3]。

因此，目前对于PD-L1能否作为肝癌免疫治疗疗效预测生物标志物尚无明确结论，仍需进一步探索。

02

TMB和MSI

肿瘤突变负荷（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）可用作多种瘤种免疫治疗疗效预测的指标，其中分别以肺癌和肠癌临床应用最为广泛。因此，既往多项研究探索了这两个指标用作肝癌免疫治疗生物标志物的可行性。

Keynote 158研究表明，在多种晚期TMB-H实体瘤中，帕博利珠单抗的疗效显著，TMB-H患者的ORR为29%，而TMB-L亚组为6%，然而该实验并未招募HCC患者[4]。一项研究分析了755个肝癌标本的基因组状态并探索一些潜在生物标志物与PD-1抑制剂反应的关系，研究发现所有分析的标本中位TMB为4 mutations/Mb，95%样本TMB＜10 mutations/Mb，TMB-H仅占1-2%[5]。迄今为止的证据表明，TMB-H对应于少数肝癌患者，因此限制了TMB作为肝癌预测性生物标志物的临床适用性。

虽然NCCN肝胆指南指出，对于不可切除和转移性胆道肿瘤患者，推荐MSI-H/dMMR检测，可从帕博利珠单抗获益。但是一项晚期肝癌基因组测序研究报道，发现仅0.2%的患者为MSI-H3，由于发生率低，将MSI状态作为肝癌免疫治疗预测的生物标志物意义不大，需要进一步的研究来评估其临床价值[6]。

因此，由于TMB-H和MSI-H在肝癌患者中发生比例非常低，在用于预测肝癌患者免疫治疗疗效中作用有限，无法指导临床方案选择[7]。

肝癌免疫治疗候选预测性生物标志物主要包含肿瘤内在因素和外在因素。随着新型检测手段的不断创新与完善，肿瘤内在因素主要通过基因组学、转录组学或蛋白组学等检测手段获取，包括突变基因（mutation）、拷贝数变异（CNA）、基因插入或缺失（indels）、基因特征（gene signature）、肿瘤抗原组（cancer antigenome）、TCR组学（TCR clonality）和免疫浸润细胞（immune cells）等，而肿瘤外在因素主要包括微生物和外周血生物标志物等指标。

01

肿瘤内在因素

一项来自GO30140及IMbrave150队列样本的多组学分析从多个层面深度分析了肝癌免疫治疗的相关生物标志物。转录组水平通过全基因组差异表达基因（DEG）、基因集富集分析（GSEA）、细胞类型去卷积分析和通路/免疫亚群特征，基因组水平分析肿瘤突变负荷、新抗原负荷、体细胞突变，再使用患者标本进行免疫组化（IHC）进行原位验证，并将相关分子特征与患者疗效及生存进行相关性分析。基因组分析发现：CTNNB1野生型、TERT突变型接受贝伐利珠单抗联合阿替利珠单抗（“T+A”）治疗后生存获益更好；CTNNB1突变型、TERT野生型接受“T+A”治疗后的生存与索拉非尼相当；转录组分析发现：预先存在的免疫相关基因高表达（ABRS, CD274，Teff）、免疫通路富集提示“T+A”疗效显著优于索拉非尼，而低表达患者接受“T+A”及索拉非尼生存获益表现一致，高比例Treg/Teff、高表达AFP和GPC3提示“T+A”生存获益与索拉非尼无差异，相反的分子特征提示“T+A”生存显著优于索拉非尼；免疫组化结果表明：相比无应答者，“T+A”应答者具有更高的免疫炎性细胞浸润，预先存在抗肿瘤能力，对比索拉非尼，具有高密度瘤内CD8+T细胞的患者接受“T+A”治疗后显示出更长的总生存（OS）[8]。这项研究有助于帮助临床患者选择合适的治疗方案，但是仍需要进一步验证其准确性和普适性。

尽管肝癌突变基因众多，但并无能真正成药的“驱动基因”，部分突变基因具有成为肝癌免疫疗效预测生物标志物的潜力。其中研究最多的明星分子为CTNNB1和p53，肝癌中CTNNB1基因突变发生率约为35%，是免疫排斥型的特征改变，可导致WNT/β-catenin通路激活，一项小样本（31例）研究表明CTNNB1突变与免疫治疗低缓解率（0% vs. 53%）、较短的中位PFS（2.0 vs. 7.4个月）和较短的中位OS（9.1 vs. 15.2个月）相关[9]。另一项临床研究对103例一线接受免疫联合治疗的肝癌患者进行分析，结果显示TP53、TERT等高频突变及TMB与反应无显著相关，而MDM4基因扩增患者接受免疫联合应答率降低明显，而MDM4是p53蛋白重要的负调控因子，可直接与p53结合并抑制其转录活性[10]。

表观遗传相关调节因子PHF19参与了多种癌症的致癌进展，并可能有助于肿瘤微环境的免疫浸润。一项研究表明，PHF19可作为泛癌种（尤其是肝癌）预后相关的致癌指标，并为临床医生提供癌症治疗的新线索。富集分析发现，PHF19参与调节包括细胞周期和DNA复制在内的致癌过程，并与肝癌的进展相关。GSEA认为PHF19与肝癌中包括免疫球蛋白复合物和T细胞受体复合物在内的细胞组分相关，基于PHF19相关的功能基因集，构建了11个基因预后标记来预测肝癌预后[11]。

此外，通过单细胞免疫标记同样可用于预测早期评估肝癌免疫治疗疗效。有研究对对来自10例接受抗PD-1单药治疗的晚期肝癌患者的连续PBMC样本进行单细胞CyTOF分析，发现患者间主要免疫亚群中可区分为纵向模式的持久临床受益（DCB）患者和非持久受益（NDB）患者。研究者确定了肝癌的阶段特异性免疫标记，并基于这些标记构建了一个逻辑AdaBoost-SVM分类器，在预测早期肝癌方面提供了优于常用血清甲胎蛋白水平的性能，揭示了来自外周血的治疗阶段特异性免疫标记及其动态变化模式，所有这些均被整合以实现对一线和二线抗PD-1单药治疗均无持久获益患者的早期鉴别。新发现的单细胞外周免疫标记为早期检测肝癌和早期评估晚期肝癌患者抗PD-1免疫治疗的疗效提供了有前景的非侵入性生物标志物，可以潜在地促进肝癌患者在未来实践中的早期诊断和新型免疫治疗，并进一步指导CyTOF在癌症研究临床转化中的效用[12]。

02

肿瘤外在因素

甲胎蛋白（AFP）作为临床上肝癌诊断及监测的重要血清学标志物，同样可用于预测肝癌免疫治疗疗效的生物标志物。GO30140表明：与基线AFP水平相比，AFP水平在6周时降低≥75%或增加≤10%与OS和应答率显著相关[13]。CRAFITY评分由基线AFP和C反应蛋白（CRP）水平组成，同样研究分析表明可用于预测肝癌免疫治疗疗效[14]。最新研究报道了新型CAR评分预测肝癌免疫治疗的能力，其结合了CRAFITY评分和6周治疗AFP反应，CAR评分预测89例接受“T+A”治疗患者的OS、无进展生存（PFS）以及肿瘤反应均优于6周治疗AFP反应或CRAFITY[15]。

ctDNA动态监测或可成为肝癌接受免疫治疗预后的标志物，在GO30140研究中，基线ctDNA水平似乎与肿瘤负荷有关；疾病进展患者与完全缓解患者相比，基线ctDNA水平更高。大多数应答者（完全缓解+部分缓解），在Cycle4Day1（C4D1）时ctDNA水平下降或不可检测，而几乎所有不应答者（疾病稳定＋疾病进展），ctDNA水平在治疗后增加或保持在可检测水平以上，此外，C2D1治疗前后ctDNA水平较低的患者PFS和OS更长，以上提示ctDNA的动态变化可能与肝癌免疫治疗疗效密切相关，有关成为预测肝癌免疫治疗疗效的新型生物标志物。

多项临床研究表明炎症相关生物标志物与肝癌免疫治疗不应答及预后密切相关，其中包括中性粒细胞淋巴细胞比值（NLR），血小板淋巴细胞比值（PLR）以及CRP等指标[14,16,17]。血清淀粉样蛋白A（SAA）与CRP类似，是一种急性期蛋白，既往研究表明肝细胞分泌的SAA是肝转移瘤生态位形成的重要细胞因子，同时与多种癌症不良预后密切相关。作者最近一项研究表明，肝细胞分泌的SAA是介导肝癌抗PD-1免疫治疗耐受的关键性因子，主要通过激活及招募肿瘤相关性细胞（TANs），促进免疫抑制微环境形成，从而介导抗PD-1治疗抵抗，而外周血SAA水平与瘤周SAA水平显著正相关，因此有望通过检测外周血SAA值作为预测肝癌免疫治疗疗效的生物标志物[18]。

参考文献：

1. Zhu AX, Finn RS, Edeline J, et al. Pembrolizumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma previously treated with sorafenib (KEYNOTE-224): a non-randomised, open-label phase 2 trial. Lancet Oncol. 2018;19(7):940-952.

2. Yau T, Park JW, Finn RS, et al. Nivolumab versus sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma (CheckMate 459): a randomised, multicentre, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2022;23(1):77-90.

3. Yau T, Kang YK, Kim TY, et al. Efficacy and Safety of Nivolumab Plus Ipilimumab in Patients With Advanced Hepatocellular Carcinoma Previously Treated With Sorafenib: The CheckMate 040 Randomized Clinical Trial. JAMA Oncol. 2020;6(11):e204564.

4. Marabelle A, Le DT, Ascierto PA, et al. Efficacy of Pembrolizumab in Patients With Noncolorectal High Microsatellite Instability/Mismatch Repair-Deficient Cancer: Results From the Phase II KEYNOTE-158 Study. J Clin Oncol. 2020;38(1):1-10.

5. Ang C, Klempner SJ, Ali SM, et al. Prevalence of established and emerging biomarkers of immune checkpoint inhibitor response in advanced hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 2019;10(40):4018-4025.

6. Le DT, Durham JN, Smith KN, et al. Mismatch repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade. Science. 2017;357(6349):409-413.

7. Hause RJ, Pritchard CC, Shendure J, Salipante SJ. Classification and characterization of microsatellite instability across 18 cancer types. Nat Med. 2016;22(11):1342-1350.

8. Zhu AX, Abbas AR, de Galarreta MR, et al. Molecular correlates of clinical response and resistance to atezolizumab in combination with bevacizumab in advanced hepatocellular carcinoma. Nat Med. 2022;28(8):1599-1611.

9. Harding JJ, Nandakumar S, Armenia J, et al. Prospective Genotyping of Hepatocellular Carcinoma: Clinical Implications of Next-Generation Sequencing for Matching Patients to Targeted and Immune Therapies. Clin Cancer Res. 2019;25(7):2116-2126.

10. Cheng J, Li Y, Wang X, et al. Response Stratification in the First-Line Combined Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma at Genomic, Transcriptional and Immune Repertoire Levels. J Hepatocell Carcinoma. 2021;8:1281-1295.

11. Zhu ZY, Tang N, Wang MF, et al. Comprehensive Pan-Cancer Genomic Analysis Reveals PHF19 as a Carcinogenic Indicator Related to Immune Infiltration and Prognosis of Hepatocellular Carcinoma. Front Immunol. 2021;12:781087.

12. Shi J, Liu J, Tu X, et al. Single-cell immune signature for detecting early-stage HCC and early assessing anti-PD-1 immunotherapy efficacy. J Immunother Cancer. 2022;10(1).

13. Zhu AX, Dayyani F, Yen CJ, et al. Alpha-Fetoprotein as a Potential Surrogate Biomarker for Atezolizumab + Bevacizumab Treatment of Hepatocellular Carcinoma. Clin Cancer Res. 2022;28(16):3537-3545.

14. Scheiner B, Pomej K, Kirstein MM, et al. Prognosis of patients with hepatocellular carcinoma treated with immunotherapy - development and validation of the CRAFITY score. J Hepatol. 2022;76(2):353-363.

15. Teng W, Lin CC, Su CW, et al. Combination of CRAFITY score with Alpha-fetoprotein response predicts a favorable outcome of atezolizumab plus bevacizumab for unresectable hepatocellular carcinoma. Am J Cancer Res. 2022;12(4):1899-1911.

16. Sangro B, Melero I, Wadhawan S, et al. Association of inflammatory biomarkers with clinical outcomes in nivolumab-treated patients with advanced hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2020;73(6):1460-1469.

17. Kim CG, Kim C, Yoon SE, et al. Hyperprogressive disease during PD-1 blockade in patients with advanced hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2021;74(2):350-359.

18. He M, Liu Y, Chen S, et al. Serum amyloid A promotes glycolysis of neutrophils during PD-1 blockade resistance in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 2024;15(1):1754.