文字/编辑：一口半夏

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黄二铁蛋白（FDPs）是一类存在于细菌、古细菌以及真核生物中的普遍存在的复合酶，值得注意的是，藻类Anabaena sp. PCC 6803生物中涵盖有四种FDP蛋白（Flv1-4），这种构成在光合作用过程中的光保护机制中扮演着不可或缺的角色。

本研究中，我们直接比较2高浓度（3% CO）和低浓度（空气中的一氧化碳）下光致氧的还原情况，即类梅勒反应（2，HC）和无机碳条件（LC），主要为了鉴定出，Flv1/Flv3杂化二聚体是维持稳态氧（O）还原的唯一有效机制。

实验最终目的是为了在低浓度环境的情况下，通过分析强烈诱导的NDH-1配合物与电子之间的相互竞争，从而进一步确定Flv1/Flv3在瞬态电子汇方面所发挥的功能。

本研究我们采用了膜进样质谱（MIMS）结合18富氧技术，在光照条件下区分光合总氧和O2的产生，同时对18O2和16O2的吸收进行了深入探究。

在实验条件下通过光合氧化体系，第二至第四的氧化还原体系细胞，在低碳浓度（LC）和高碳浓度（HC）环境中，均积累了大量的Flv2、Sll0218和Flv4，并在空气中（CO2浓度大于1%）以及高碳浓度环境（HC）条件下，证明细胞中更高的O2光还原速率。

在低碳浓度（LC）和高碳浓度（HC）条件下，flv4-2/ OE（过表达）细胞与野生型（WT）细胞的Flv 3蛋白水平相似，这强有力地支持在光合过程中，flv4-2操纵子蛋白对O2光还原在细胞内的贡献。

值得注意的是，在LC条件下生长的flv4-2/ OE和WT细胞的O2进化率之间没有显著差异，然而，在flv4-2/ OE细胞中，总O2进化率显著增加。

如前所述，二氧化碳浓度（Ci）水平对于FDP在转录本和蛋白质水平上的表达产生显著影响：Flv2、Flv4和Flv3的表达已在低碳浓度（LC）条件下得到证实，并在转向高碳浓度（HC）条件时表达。

从黑暗环境中的转变后，野生型（WT）细胞在低碳浓度（LC）和高碳浓度（HC）条件下，呈现出显著快速的光诱导O2摄取，具体地说，其摄取速率分别为每小时59±6.4和56±6.4微摩尔氧化2分子/毫克叶绿素a。

这个迅速的响应阶段在本实验中得到了表现，然而，在低碳浓度（LC）条件下培养的细胞与在高碳浓度（HC）条件下培养的细胞相比，其O2光还原动力学表现出差异。

当野生型（wt）细胞的培养经过快速诱导期{i}后，明显地观察到了O2相的猝灭现象。

在O2还原过程中，首先经历了一个强烈的衰减相，其持续时间约为1分钟，随后，进入了一个相对稳定的状态，在这个状态下，O2还原速率约为每小时33 ± 5.9微摩尔氧化2分子/毫克叶绿素a，这一过程发生在照明期间。

与此相反，在 HC 生长的 WT 细胞中，光诱导的氧还原速率在阶段{ I }中仅在最初的2-3分钟内略有下降（从约56 ± 2微摩尔氧化2分子/毫克叶绿素a）。

在实验过程中我们发现,O2光还原动力学在flv4-2细胞中与其相应的野生型（WT）细胞类似，在HC条件下，光还原动力学趋于稳定，而在LC条件下，flv4-2细胞的O2光还原反应则呈现出强烈的双相猝灭现象。

为了研究在LC条件下的吸收和呼吸与O2光还原之间的关系，我们进行了针对M55突变体（Δ ndhB）的实验，M55突变体由于其疏水性的NdhB亚基缺失，因而缺乏整个NDH-1复合物。

在LC条件（pH 8.2）下生长的M55突变细胞表现出与野生型类似的特性：在光诱导条件下迅速产生O2光还原（第一阶段），随后维持稳态状态，但缺乏O2的第二阶段现象。

综上所述，在光合暗适应阶段转向光照环境后的光还原过程中，M55突变体的行为与野生型（WT）细胞存在差异，同时与野生型细胞相比，M55突变体表现出较为缓慢的诱导过程，并且总氧进化速率明显降低。

这提示M55突变体的稳态O2光还原状态并非源于从PSII增加的电子流。

我们对生长培养基的pH值以及其中碳酸盐的存在进行了评估，以探究它们可能作为调控剂影响梅勒样反应的程度和动力学，以及在（LC）条件下FDPs的积累情况。

在pH值为9的环境中生长的WT细胞表现出明显而短暂的Mehler样反应特征：O2光还原率在最初的30秒光照后达到最大值，然后在接下来的1分钟内迅速降至初始暗态的氧水平。

与WT相似，flv4突变体细胞在光照条件下也只表现出短暂的O2光还原特征，然而，在pH9的环境中生长的flv1/∆flv3和∆flv3/∆flv4突变体细胞中，并没有明显观察到O2光还原的迹象。

特异性抗体免疫印迹的结果表明，在高碳浓度条件下生长的WT细胞，在低碳浓度且pH值为9的条件下，几乎无法检测到Flv2和Flv4蛋白的存在。

与蛋白质数据的一致性相符，对于pH为9的细胞环境，我们观察到Flv2和Flv4的转录水平均显著下调，这强烈暗示了pH对于四联体Flv2和Flv4的转录调控存在重要的依赖性。

这些结果极具说服力地表明，在pH为9的条件下，明显且短暂的O2光还原在野生型（WT）和flv4突变细胞中，主要归因于Flv1/Flv3异二聚体的活性。

通过上述数据，我们能够对O2的不同动力学阶段的起源作出初步结论

为了进一步确定Flv2/Flv4异二聚体相关的O2光还原过程，我们将重心放在flv4-2/OE突变体身上，其在LC、pH值为7.5以及不含碳酸盐的条件下进行生长。

在这个突变体中，我们观察到Flv2和Flv4蛋白的积累显著增加，同时其O2光还原速率较WT更为显著，当线性电子传递受到细胞色素b6f（Cyt b6f）水平的限制，尤其在使用DBMIB作为抑制剂的情况下，这种现象更为显著。

在使用DBMIB作为抑制剂的情况下，flv4-2/OE突变细胞表现出强烈的光诱导O2吸收，与之预期一致，在存在DBMIB的情况下，Δcyd突变细胞的光诱导O2吸收未被检测到。

通过实验证明，Flv 1/flv 3杂二聚体通过在Mehler类反应中作为一种有效的电子汇发挥作用，使细胞在波动光下生长。

然而，目前的研究结果清楚地表明，在Mehler样反应中的Flv2/Flv4异二聚体的额外参与，特别是在LC的条件下和在pH值为8.2或更低中选择所需的构件。

这些发现使我们更准确地研究了生长培养基的pH值，和波动生长光条件(FL)对各种FDP突变体生长性能的综合影响，为达此目的，我们施加了严格的光照条件，FL20/500）和温和的光照条件（FL50/500）来模拟光强度的波动。

在严格的条件下，每隔5分钟会暂停20 µ 摩尔光子m −2 s −1 背景光，借着30秒光脉冲强度为500摩尔光子m ~ 2 s ~ 1 与 温和（ FL50 / 500 ，当 50 个 { mol 光子 m - 2 秒 - 1 个背景光，每 5 分钟被 30s 光脉冲强度为 500 的脉冲干扰时） μ mol 光子 为 2 s 为 1 波动的光施加在不同的pH值水平。

从实验结果来看Flv1/∆flv3突变体（∆flv3/∆flv4）在严峻的光波动条件（FL20/500）下无法维持生长，而这一现象与生长介质的pH值无关。

然而，在较为温和的光波动条件（FL50/500）下，这一突变体在碱性pH值（例如pH 9）环境下的生长速度较野生型相比较慢，这一现象同样在pH 8.24的条件下观察到。

同时实验研究发现Flv4突变体在所有不同的pH水平下，无论是在轻度或重度光波动条件下，都表现出与野生型细胞相似的生长特性。

更值得注意的是，在pH值为7.5和8.2的条件下，第二阶段∆sll0218和第四至第二层OE突变体的生长情况也得到了研究。

通过对不同科囊藻突变体中各种FDP积累的特异性影响进行表征，我们得以阐明Flv2、Flv4以及Flv1、Flv3蛋白在体内O2光还原过程中的参与。

人们普遍认为Flv1/Flv3蛋白在HC和LC条件下保护PSI，编码的蛋白质，而由 flv4-2 在LC下高度表达的操纵子在PSII的光保护中起着重要作用。

通过系统的实验和分析发现， 科囊肿 表达的Flv4 大肠杆菌 能够产生依赖于NADH的O 2 -体外还原作用，然而与来自厌氧原生动物的FDP的活性相比，报告的反应速率极低（几乎是残留的）该酶对NADPH无亲和力

同时科囊肿 蛋白质导致一种说法，即Flv3在依赖NADH的O2光还原过程中，与二聚体可能发挥相似的作用。

与Flv1-OE和Flv∆3-OE（或Flv1∆3-OE）突变体相比，Flv2蛋白的亲和力降低了（对NADPH的亲和力非常低），这些结果清楚地表明，在体内的光还原过程中，Flv3（或Flv1）的同聚物并不在O2中发挥作用。

尽管O2的光还原能力通常与科囊肿的FDP丰度相关，然而蛋白质丰度并不是决定O2光还原能力的唯一因素。

实际上，尽管高效且稳定的O2光还原在高浓度（HC）条件下的细胞中得以观察，但却几乎无法检测到Flv 2和Flv 4的水平，这与低浓度（LC）条件下的水平相比，Flv 3的含量较低。

此外，通过在pH 7.5条件下省略从BG-11生长培养基中获取的碳酸钠，我们观察到O2光还原率的增加，并且这并没有引起FDPs的显著转录和蛋白质水平的变化，这提示了可能存在氧化还原调节酶的活性。

在本研究中，我们提供了关于Flv2/Flv4对体内O2光还原的贡献的有力证据，通过应用光还原18O标记氧和实时气体交换测量不同FDP缺失突变体。

同时也深入分析了其中的细节：灭活Flv2或Flv4被证明导致O2光还原的幅度显著减少，相较于野生型细胞，而过表达Flv4-2操纵子则将O2光还原速率提高了近两倍。

值得注意的是，小蛋白质 Sll0218 促进类似 Mehler 反应的可能性被排除在外，同时科囊藻的O2光还原能力通常与FDP的丰度相关，然而，蛋白质的丰度并不是决定O2光还原能力的唯一因素。

尽管如此，实验的数据并不排除Flv 2/Flv 2和/或Flv 4/Flv 4同齐聚物，也参与O以外的过程的可能性，这种情况发生在Flv 1和Flv 3蛋白中，它们作为同配体在波动的光照条件下对细胞进行光保护。

在pH 8.2的条件下，完全消除了光诱导的O2吸收现象，而在pH 7.5以及存在电子传输抑制剂DBMIB和HQNO的情况下，对于生长在此条件下的WT细胞而言，FDP驱动的O2光还原有所减少。

这显示FDP驱动的O2光还原并不在PSII或PQ-pool水平上发生（无论是通过Flv1/Flv3还是通过Flv2/Flv4）。

这个结论也得到以下事实的支持：与缺陷的FDPs的WT和突变体不同，cyd突变体在存在二溴甲基溴的条件下不表现出光诱导的O2吸收。

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