导语
Mentha spicata L.通常称为留兰香，是属于唇形科薄荷属的多年生草本植物。留兰香是留兰香油的来源，是世界交易量最大的十大精油之一。这种油广泛用于制药、化学、食品和化妆品等领域。目前，已经从留兰香油中鉴定出了40多种化合物，包含多种活性成分。以往的研究已经记录了留兰香对各种昆虫的杀虫活性，使其成为常用的植物-昆虫和病原体控制剂。此外，发现了受留兰香芳香疗法控制的智能细胞在治疗慢性疼痛方面具有潜力。留兰香还具有其他生物学用途，如增强记忆、抗血小板和抗痉挛。尽管其在工业和经济上具有重要意义，但对留兰香基因的研究较少。其线粒体和核基因组尚未发表。留兰香复杂的线粒体基因组又是什么样的构象？该如何进行复杂植物线粒体完成图的组装？我们一起来看看吧！
文献标题：Complete mitochondrial genome of Mentha spicata L. reveals multiple chromosomal configurations and RNA editing events
发表期刊：International Journal of Biological Macromolecules
影响因子：8.2
发表时间：2023.08
研究思路
主要研究结果
1. 留兰香线粒体基因组的组装和注释
测序后，共获得了约9.3Gb的Nanopore clean reads和5.5Gb的illumina测序clean reads。使用混合组装策略组装留兰香的线粒体基因组，生成了一个具有17个重复序列的unitig图，显示了双分叉结构。使用Unicycler软件解析该双分岔结构，最终得到了一个线性序列和两个环状序列。这三条序列被鉴定为线粒体染色体，分别命名为染色体1（Ch1）、染色体2（Ch2）和染色体3（Ch3）。这个线粒体基因组编码了总共24个核心蛋白编码基因、三个可变蛋白编码基因、三个核糖体RNA（rRNA）基因和六个转运RNA（tRNA）基因。
2. 重复序列介导的同源重组
重复序列经常参与同源重组。在unitig图中，有多个重复序列位于分支点处（红色矩形）。其中的两个重复序列R1和R2被确认为介导重叠群重组的片段，重复序列两侧的序列分别命名为contig1–7（C1–7）。对于R1，在组装的线粒体基因组序列中，构型为C1 → R1 → C2，C3 → R1 → C4。在重组后，序列配置变为C1 → R1 → C4，C3 → R1 → C2。同样地，对于R2，重组后为C7 → R2 → C2，C5 → R2 → C6。在重组后，序列构象变为C7 → R2 → C6，C5 → R2 → C2。
为了验证重复序列R1和R2周围存在不同的构型，将Nanopore测序生成的长reads映射到C1 → R1 → C2，C3 → R1 → C4，C1 → R1 → C4，C3 → R1 → C2，C7 → R2 → C2，C5 → R2 → C6，C7 → R2 → C6，C5 → R2 → C2等序列。对于R1和R2，组装和重排构型的比例分别为58.33％：41.67％和53.00％：47％。这表明，组装的构型是留兰香线粒体基因组的主要构型。
此外，根据R1和R2的四种构型的侧翼序列设计了引物进行PCR扩增，PCR产物的长度与预期大小相符。随后，对这些产物进行了Sanger测序，测序结果也与预期一致。这个结果表明，重复可以介导重组，推动线粒体基因组形成不同的构型。
3. 重复序列分析
留兰香的线粒体基因组中识别了简单重复序列（SSRs）和串联重复。在Ch1、Ch2和Ch3中分别识别出了约36、17和9个SSR。这些SSR的重复基序长度为1-6个核苷酸，其中四个核苷酸的SSR数量最多。在留兰香的线粒体基因组中只有很少的串联重复。在Ch1、Ch2和Ch3中仅发现了五个串联重复。将Ch1、Ch2和Ch3染色体之间的重复称为染色体内重复（ICR）。分别在Ch1和Ch2、Ch1和Ch3、Ch2和Ch3之间识别出了13、12和3个具有100％相似性的ICR。其中一个重复序列ICR07，长度为95bp，并在Ch1、Ch2和Ch3之间共享。为了验证组装错误没有导致这些重复，通过长reads映射来验证它们。结果显示，这些ICR得到了跨越整个片段的长reads的支持。
4. 叶绿体基因组同源序列分析
众所周知，DNA可以在线粒体基因组和叶绿体基因组之间转移。MTPT是指线粒体基因组中存在叶绿体来源的DNA片段。为了分析留兰香线粒体基因组和叶绿体基因组之间序列转移事件的发生，对两个细胞器基因组进行了比较分析。结果表明，留兰香线粒体基因组与叶绿体基因组之间存在17对相似序列片段，序列长度在90 ~ 2027 bp之间。长reads映射到MTPT序列上的结果为这些MTPT序列的真实性提供了支持。
5. 留兰香系统发育分析
基于线粒体和叶绿体基因组序列，分析了留兰香和18个唇形目物种之间的系统发育关系。结果显示，以茄科植物天仙子（Hyoscyamus niger）为外群，根据两种细胞器的PCGs构建的系统发育树拓扑结构一致，且与NCBI分类学数据库中显示的传统分类一致。
6. 留兰香线粒体基因组中的RNA编辑事件
RNA 编辑是指在特定位点对 RNA 序列进行特定修饰，该序列可能来自模板。这种现象在植物有丝分裂基因组中很常见。基于 6.4 G RNA 测序数据，对留兰香线粒体基因组 PCGs 中的 RNA 编辑位点进行了检测。共检测到 246 个 RNA 编辑位点。随后，利用 WGS-seq 数据进行了 SNP 鉴定，以消除来自线粒体基因组内多态位点的假阳性。结果显示，SNP 与 RNA 编辑位点之间没有重叠，表明这些碱基的变化发生在转录后。这些 RNA 编辑位点分布在 25 个基因中。其中，nad7 基因 的 RNA 编辑位点最多，共有 21 个。
为了评估这一预测的准确性，随机选择了五个基因，共预测出 43 个 RNA 编辑位点。为此采用了 PCR 扩增和 Sanger 测序相结合的方法。其中，40 个 RNA 位点（40/43 = 93 %）被成功验证。
总结
该文章结合 Illumina 读数和 Oxford Nanopore 读数组装了留兰香的高质量线粒体基因组。同时，利用长读数解析了留兰香复杂的线粒体基因组构象，揭示了其线粒体基因组中存在重复介导的重组。此外，还通过利用 PCR 扩增和 Sanger 测序技术，有效地验证了共 40 个 RNA 编辑位点。总之，该文章为研究植物线粒体基因组结构，尤其是重复介导的重组提供了有价值的信息。同时，它还为线粒体和叶绿体基因组之间的基因转移和进化提供了视角。
参考文献
Jiang M, Ni Y, Zhang J, Li J, Liu C. Complete mitochondrial genome of Mentha spicata L. reveals multiple chromosomal configurations and RNA editing events. Int J Biol Macromol. 2023 Aug 12;251:126257. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.126257. Epub ahead of print. PMID: 37573900.
