实时定量PCR（RT-qPCR）是一种在DNA扩增反应中，通过荧光化学物质测量每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，常用于定量分析特定DNA序列。以下是RT-qPCR的实验操作流程： 🔬 实验原理：Real-time PCR通过荧光信号对PCR进程进行实时监测，模板的Ct值和起始拷贝数在指数扩增期存在线性关系，成为定量的基础。 🔍 引物设计：引物设计需遵循一般原则，产物长度应控制在80-150bp，以保证扩增效率和特异性。 🧪 RNA提取：提取细胞总RNA，包括清洗、裂解、分离和沉淀RNA步骤。 📏 RNA浓度测定：使用如Nano drop等仪器测定RNA浓度。 🔄 反转录合成cDNA：使用反转录酶将RNA转换为cDNA，作为qPCR的模板。 🧪 qPCR反应体系配置：实验通常使用2×浓缩的real-time qPCR MasterMix。需要加入模板和引物。每个样品至少做3个平行孔，以确保数据的可统计性。 💻 上机操作：将配置好的反应液放入实时qPCR仪中，设置相应的温度循环和采集模式，进行扩增检测。real-time qPCR不需要常规PCR的三步法（变性、退火、延伸）。 由于产物长度短（80-150 bp），通常只需要变性和退火步骤。 使用SYBR Green等染料时，PCR后应加溶解程序以形成溶解曲线，判断特异性扩增。 📊 数据分析：通过扩增曲线和融解曲线分析，可进行相对定量或绝对定量分析。相对定量用于比较靶基因在不同样本中的表达差异，绝对定量用于测定样本中靶基因的确切拷贝数。 🚫 常见问题分析：注意MasterMix不要反复冻融，常使用时可溶解后存放于4°C。 配制时应在冰上操作，每管或每孔换新枪头，避免加样误差。 如无Ct值出现、Ct值出现过晚、标准曲线线性关系不佳、负对照有信号、溶解曲线异常、扩增效率低等问题，需针对具体情况进行调整和优化。