当代读书人 PCR实验步骤 [科研]PCR实验计算十技巧(保姆级教程) 1️⃣.将高保真酶、引物(上、下)、模版、无酶水放冰中 2️⃣.准备: PCR管中加入:20uL体系 高保真酶(2x)10uL、 引物各luL、 模版luL、 200ul、20ul、2.5ul量程的移液枪、配套去酶枪头、 1.5ml去酶EP管、 八联管、 八联管盖、PCR管盒、引物、 TBqreen、DEPC水、sample、镊子、笔计算: 高保真酶 25uL引物各2uL模版2uL无酶水19uL附如果进行菌落验证则无酶水加8/21uL 3️⃣标记target，加入对应量上引物、下引物、TBgreen、DEPC水(先加DEPC水，再加 TBgreen，最后加引物，注意枪头必须伸入液面以下并吹打均匀)PCR管离心混匀，放入PCR仪中 4️⃣调整PCR仪的参数💡(与酶、引物、目的片段的长度等有关)PCR反应过程中，要使用三个不同的温度变化，有变性，退火,延伸三个不同的反应阶段，这三个反应需要的最适温度不同: 变性温度🌷:高温破坏模版DNA两条链上碱基之间的氢键.导致两条链分离,产生两条单链的DNA。 退火温度🌷:温度降低，使DNA引物通过氢键的方式附着在单链DNA模板的特定区域上,这一阶段使用的最佳温度取决于反应中使用的引物的熔解温度。 延伸温度🌷: 最后阶段，温度被提高到72℃.以促进高保 真酶合成新的DNA，通过向模板添加DNA碱基促进新DNA的合成结束后跑胶验证，成功后可进行后续胶收 PCR 反应注意事项:⚠️ ‼️1️⃣特别注意防 DNA污染发生，样品间相互污染可产生假阳性结果 2️⃣.公用的、没有密码保护的PCR仪，需经常检查其程序正确与否 3️⃣.不使用过量试剂,"less is usually better (more specific)" 4️⃣.试剂购回后应分装成小份使用 5️⃣.加完所有试剂后用枪头吹打几次以保证充分混匀 6️⃣.使用阴性对照可检测污染収生，使用阳性对照有劣于良好扩增样本 7️⃣.电泳时使用DNA分子量标准品(判定是否PCR失败或防止条带跑出凝胶)