🔑 Western Blot的图最后会得到白色背景上的黑色条带，条带越黑说明蛋白量越多。一般来说好看的条带就是该黑的地方黑、该白的地方白。所以优化WB的图就应该从这个角度考虑，来优化步骤。 📝 样本制备 1⃣ 充分裂解：确保样本彻底裂解，以释放所有蛋白质。使用物理方法（如超声）和化学方法（如含有SDS的裂解液）。 2⃣ 去除杂质：通过离心去除未裂解的细胞碎片和未被裂解的蛋白质，以减少电泳过程中的杂质。 3⃣ 蛋白酶抑制剂：添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。 4⃣ 准确定量：使用BCA等方法准确测定蛋白浓度，确保每个泳道的蛋白量一致。 🌐 SDS-PAGE电泳 1⃣ 凝胶浓度：根据目标蛋白的分子量选择合适的凝胶浓度。大分子量蛋白通常使用4%-6%的凝胶。中等分子通常使用8%-10%的凝胶，小分子通常使用12%-15%的凝胶。如果目标蛋白的分子量范围较宽，可以考虑使用梯度凝胶。 2⃣ 上样缓冲液：使用新鲜的上样缓冲液，并确保样品与上样缓冲液充分混合后变性。 3⃣ 调整上样量：如果蛋白表达量低，可以增加上样量。 🔄 转膜 1⃣ 转膜条件：优化转膜时间、电压和缓冲液，特别是对于大或小分子量的蛋白，确保蛋白质有效转移至膜上。 🚫 封闭 1⃣ 封闭液：使用5%脱脂奶粉或BSA作为封闭剂室温封闭1小时。 2⃣ 封闭时间：可以考虑延长封闭时间以确保完全封闭。 🔬 抗体孵育 1⃣ 一抗选择：选择高特异性的一抗，并根据制造商的建议进行稀释，太高容易导致非特异性结合，太低会导致目标条带弱、背景黑。 2⃣ 二抗选择：选择与一抗宿主相匹配的二抗，并使用适当的标记。 3⃣ 抗体配置：使用BSA或专用的抗体稀释液配置抗体，具有一定的封闭作用。 4⃣ 孵育时间：一抗一般4℃过夜，二抗一般室温1小时。延长孵育时间和提高孵育的温度会有助于抗体和目标蛋白的结合，但是也容易导致更多的非特异性结合。 🧼 洗涤 1⃣ 洗涤次数：在一抗和二抗孵育后，充分洗涤以去除未结合的抗体。 2⃣ 洗涤液：使用TBST或其他洗涤液，添加吐温-20以减少非特异性吸附。 3⃣ 洗涤平衡：洗涤也不能过分，避免一抗和二抗被过度清洗。 📸 ECL显影 1⃣ 发光液现配现用：确保ECL试剂新鲜，避免影响显色效果。 2⃣ 曝光时间：根据信号强度调整曝光时间，避免过曝导致条带过黑。 3⃣ 超敏检测：对于表达量低的蛋白可以使用超敏化学发光液和接触式化学发光仪。