[大笑R]昨天摇完菌，今天该来提质粒啦！对于一个新的质粒，可以留些菌液作为甘油菌保存在-80℃，以后再提质粒就不要转化，直接戳点甘油菌摇起来就好了。而质粒小提虽然看起来步骤繁多，其实也就是在过柱子过柱子。今天师兄来讲一下不提质粒的步骤和注意事项。 🔍质粒小提、中提、大提是什么？ 区别在于获取的DNA的量。小提通常使用1-5ml菌液，中提使用30-50ml菌液，大提使用100-500ml菌液。一般我们做实验，小提或者中提就够了。 质粒小提的步骤： 1⃣柱平衡 向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，12.000rpm离心1 min，弃废液。 2⃣裂解，中和 📌12000rpm或4000rpm10min离心菌液。向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μ溶液P1（原理：含缓冲液，并重悬细菌），彻底涡旋或吹打，重悬菌体。若菌量很多，可以增加P1用量。 📌加入等体积溶液P2（裂解液，强碱性），温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，注意温和操作，这一步时间不要超过5min。如果菌液未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底。 📌向离心管中加入与P1等体积的溶液P4（中和碱性环境，沉淀蛋白质），立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色的絮状沉淀，然后室温放置10 min，12,000rpm)离心10 min。 3⃣分离DNA 📌将上一步收集的上清液分次加入过滤柱（每次不超过700ul），12,000rpm离心2 min，收集滤液。 📌向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染) 📌将滤液转移到吸附柱中（每次不超过700ul），12,000 rpm离心1 min，弃滤液。 4⃣洗涤DNA 📌向吸附柱中加入500 μ去蛋白液PD，12,000 rpm离心1 min，弃滤液。 📌向吸附柱中加入600 μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1 min，弃滤液。重复一次。 📌12,000 rpm离心2 min，彻底去除吸附柱中残余的漂洗液。 5⃣洗脱DNA 📌将吸附柱置于干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 ul洗脱缓冲液TB，室温放置2 min，12,000 rpm离心1 min将质粒溶液收集到离心管中。为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复离心。最近入手的这个冻存管质量很好，耐超低温，盖子也不容易开，放在台面上不容易倒。