碱基编辑技术公司Beam Therapeutics，最近在一次科学会议上展示了在研乙肝新药胞嘧啶碱基编辑在体外和体内抑制乙肝病毒复制并调降乙肝表面抗原（HBsAg）表达的新数据，以下是该进展完整数据。

乙肝在研新药胞嘧啶碱基编辑，在体外和体内，临床前完整数据公布

Beam公司介绍，目前，HBV基因组作为游离型共价闭合环状DNA（cccDNA）在肝细胞中持续存在，它是慢性HBV感染的原因。同时，HBVDNA整合到人类基因组中并作为 HBsAg 表达的来源。已获批标准疗法（核苷（酸）类似物（NAs）逆转录酶抑制剂）可减少HBV复制，但还不能治愈，也不影响cccDNA和整合的HBVDNA的病毒蛋白表达（HBsAg）（Revill 等，2019）。

胞嘧啶碱基编辑器 (CBEs) 可将 C-G 转化为 T-A，而不会出现双链断裂。起始DNA序列与目标碱基对（C:G）。胞嘧啶碱基编辑器 (CBEs) 由脱氨酶 (绿色) 融合的部分失活的 CRISPR 蛋白 (灰色) 组成。引导RNA（gRNA）将 CBE 引导至目标基因组DNA序列，并暴露狭窄的编辑窗口。脱氨酶通过脱氨作用将胞嘧啶 (C) 化学修饰为尿嘧啶 (U)，Cas酶在相反链上形成切口。尿嘧啶被DNA聚合酶读取为胸腺嘧啶。修复有缺口的链，完成 C:G 到 T:A 碱基对的转换。

Beam的碱基编辑乙肝创新疗法，旨在通过在HBV基因中引入终止密码子，潜在功能性治愈HBV。用 CBE 靶向HBV基因组将允许在病毒基因中精确和永久地引入终止密码子/错义突变，而不会产生 DSB，从而最大限度地降低染色体重排/缺失风险。

碱基编辑将使用相同的试剂来解决慢性乙肝的两个关键方面：其一是可通过在cccDNA中引入永久性突变来防止HBV反弹，其二是在没有 DSBs 的情况下，不可逆地沉默整合HBVDNA中的 HBsAg 表达。设计了一种碱基编辑方法，以针对HBV基因型D的保守HBV区域（用于建立大多数体外和体内HBV感染的临床前模型）。使用 BE4 碱基编辑器多路复用两个 gRNA 同时降低 HepG2-NTCP 中的HBV参数：

两个先导 gRNA 在HBV基因中引入终止密码子，HBs (gRNA S1) 和 Precore (gRNA C2)（可见上图）。结果表明，碱基编辑器通过cccDNA编辑发挥作用，而不会降低cccDNA水平。相对于用靶向无关 PCSK9 基因的碱基编辑试剂处理的对照样品，碱基编辑导致病毒细胞外（HBsAg、HBeAg）和细胞内（3.5kbRNA 和 HBV DNA）参数有效降低；BE4/gRNAs(S1+C2) 处理抑制所有 HBs 亚型，如在蛋白质印迹中观察到的。

拉米夫定联合治疗导致乙肝病毒标志物的显著降低，与 A 组类似。碱基编辑不会降低 HepG2-NTCP 中的 cccDNA 水平 (E) NGS 对 cccDNA 富集样本评估的编辑。用拉米夫定预处理可使 HepG2-NTCP 中的碱基编辑率提高 20%。 Lam 预处理条件下的高 cccDNA 编辑表明 CBE 直接靶向 cccDNA。

碱基编辑可防止 PHP 病毒反弹（可见上图）。HBV DNA qPCR在原代肝细胞（PHH）上清液中评估的HBV复制。当停用拉米夫定会导致乙肝病毒反弹，而使用碱基编辑可防止乙肝病毒反弹。碱基编辑导致 HBsAg、HBeAg、HBVDNA，3.5kb RNA 的有效减少。NGS 对 cccDNA 富集样本的编辑进行了评估：~55% 编辑 HBs 和~80% 编辑 PreCore 基因。

碱基编辑从自然整合的 HBVDNA 中减少 HBsAg（可见上图）。在 BE4 mRNA 和 gRNAS1* 转染后第6天通过 ELISA 测定细胞外 HBsAg 水平。约 50% 的 HBs 基因编辑足以实现 HBsAg 的稳健降低。*gRNAS1 适用于匹配 PLC 细胞中整合的HBVDNA。

LNP 介导的 BE4 mRNA 和 gRNA S1/C2 的传递导致 HBV 小鼠模型中病毒标志物的持续减少（可见上图）。HBV 小环小鼠模型支持 HBV 样病毒颗粒的持久产生和免疫活性小鼠中 HBV 抗原的表达（Yan 等，2017）。在流体动力学注射 cccDNA 样小环质粒 4周后，小鼠接受一剂或两剂（2x）碱基编辑试剂（mRNA 和 gRNA 配制成脂质纳米颗粒 (LNP)，浓度为 2mg/kg）；恩替卡韦 (ETV) 治疗的小鼠口服 0.03mg/kg 抗病毒药物两周，然后停止治疗；

评估碱基编辑试剂在HBV小环小鼠模型中的抗病毒作用。 在第一次注射碱基编辑试剂 BE4/gRNAs(S1+C2) 后第 35 天（6 周）：平均 HBsAg 降低 > 2log； 6/9试验小鼠的 HBsAg 降低至检测限以下；HBV复制在恩替卡韦治疗的小鼠中减少，然后在停用后立即反弹（阳性对照）；在碱基编辑治疗组中，血清HBVDNA持续降低 >3 log；无HBV反弹；2次 LNP 注射可更好地降低血清HBVDNA；第一次 LNP 注射后两周，所有试验小鼠的 HBeAg 表达均低于检测限。

综上所述，研究人员对上述最新临床前乙肝碱基编辑器结论：在HBV基因 HBs 和 Precore 中引入终止密码子的两个 gRNA 与 CBE 多路复用导致 HepG2-NTCP和 人类原代感细胞中的 HBsAg、HBeAg、HBVDNA和 3.5kb RNA 同时减少；在药物作用机制（MoA）上，乙肝病毒标志物水平的减少似乎是由cccDNA的碱基编辑驱动的，而cccDNA水平没有降低；

碱基编辑大大降低了自然整合的HBV序列产生的 HBsAg；在HBV小环小鼠模型中的体内 Poc 观察到，静脉注射 LNP 与 HBV靶向碱基编辑器一起导致 HBsAg 持续降低，一些小鼠显示 HBsAg 消失，以及 HBeAg 和血清HBVDNA的降低。综合起来，这些临床前数据表明，碱基编辑可以通过引入突变消除HBV复制和沉默病毒蛋白表达，使cccDNA和整合的HBVDNA失活。

小番健康结语：昨天更新的是这种临床前开发阶段乙肝病毒碱基编辑器（CBEs）的核心结论与Beam公司的点评，今天更新的是这项临床前新进展的完整动物试验数据。综合来说，Beam公司想要表达的观点是，这种胞嘧啶碱基编辑器在体外和体内模型中证明，既可以抑制乙肝病毒复制，又可以降低乙肝表面抗原的表达。