作者：王美霁 李锋
单位：复旦大学上海市重大传染病和生物安全研究院；上海市公共卫生临床中心结核病研究中心
引用本文: 王美霁, 李锋. 脂阿拉伯甘露聚糖抗原检测用于艾滋病病毒感染者和艾滋病患者结核病诊断的研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2024, 47(5) : 475-480. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20231114-00310.
摘要
结核病是艾滋病病毒感染者和艾滋病患者（people living with HIV/AIDS，PLWHA）死亡的主要原因，给其带来巨大的疾病负担，在PLWHA人群中早期筛查结核病，是降低传播、控制其病情发展的关键举措。脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是MTB的糖脂，可以在结核患者尿液中检测到，LAM有助于快速、准确诊断结核病。本文综述了LAM及其在PLWHA诊断中的应用与局限性，希望为PLWHA结核病的诊断提供参考依据。结核病是艾滋病病毒感染者和艾滋病患者（people living with HIV/AIDS，PLWHA）死亡的主要原因，据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）统计数据显示，2021年艾滋病相关疾病死亡人数为65万，其中因结核病造成的死亡人数高达18.7万［1, 2］。这种高致死率背后的成因正是艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）两种病原体的相互促进。一方面，HIV感染使机体罹患活动性肺结核的风险大大增加［3］，另一方面，结核病增加了HIV-1的复制、传播和遗传多样性［4］。在PLWHA人群中早期筛查结核病，是降低传播、控制其病情发展的关键举措。结核病的传统诊断方法如涂片染色镜检，敏感度相对较低，而MTB的培养则需要专门的实验室且耗时长［5］。新技术如Xpert MTB/RIF和Xpert MTB/RIF Ultra，敏感度较高但依赖于一定的基础设施且成本高昂。一些有结核病症状的患者因为缺少痰液标本，难以使用上述方法来诊断结核。此外，晚期免疫抑制的HIV合并结核病患者的痰液或者其他体腔液中细菌载量较低，在一定程度上降低了诊断的敏感性［6］。因此，WHO建议开发一种快速、基于非痰液的结核病诊断方法［7］。脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是MTB的糖脂，在MTB结构的完整性和结核病的发病机制中起到了关键作用。本文综述了LAM及其在PLWHA诊断中的应用与局限性，希望为PLWHA结核病的诊断提供参考。一、结核分枝杆菌LAM
脂阿拉伯甘露聚糖是分枝杆菌属细胞壁上脂多糖的一种成分，约占细菌总干重的15%［8］。在MTB、麻风分枝杆菌和牛分枝杆菌等致病性分枝杆菌中，LAM的阿拉伯糖链末端连接数个甘露寡糖，形成甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖（mannosecapped lipoarabinomannan，ManLAM）；在耻垢分枝杆菌等非致病性分枝杆菌中，LAM的阿拉伯糖链末端连接磷酸肌醇，形成磷酸肌醇修饰的脂阿拉伯甘露聚糖（phosphatidyl-myo-inositol capped LAM，PILAM）。LAM通常被认为是MTB的毒力因子，在调节宿主免疫应答和MTB感染的发病机制中起到了关键作用［9, 10, 11］。二、基于尿液样本的LAM检测
（一）基于尿液LAM检测尿液LAM检测是结核病诊断的重要工具，具有反映分枝杆菌细菌负荷的潜在优势［12］。尿液作为一种无菌且容易获得的体液，即使是痰液缺乏的患者也可以进行检测。与血液、呼出气体以及痰液相比，尿液因其易于获取、处理和储存以及样本采集过程中对医护人员的低感染风险等优势受到持续关注［13］。目前，WHO推荐使用AlereLAM诊断肺结核，荟萃分析结果显示，在符合WHO筛查标准的HIV阳性住院患者中，AlereLAM的敏感度和特异度分别为48%和96%，具有良好的效用［14］。（二）尿液LAM诊断结核病的机制与概况1. 尿液LAM诊断结核病机制：早期研究认为，LAM抗原尿是由血液中游离循环的LAM经过肾小球过滤所引起的［13，15］。然而，血液中LAM并不以单体的形式存在而是与高密度脂蛋白胆固醇等载体结合，在肾小球功能正常的情况下不太可能直接经过滤过作用进入尿液［16］。基于MTB菌血症与LAM阳性尿液之间的强烈关联［17］以及Cox等［18］尸检队列数据提供的大多数LAM阳性患者有肾结核感染的组织学证据，Lawn［12］认为，LAM抗原尿是由血源性结核病播散导致肾脏受累所引起的。从分子、微生物、组织解剖学等多方面探索LAM进入尿液的机制，可为开发新的基于LAM的诊断技术以及将其应用于最合适的诊断群体提供依据。2.尿液LAM诊断结核病历程：早在2001年，Tessema等［19］在结核病患者尿液中检测到LAM，首次报告了LAM诊断结核病的潜在价值。随后该团队通过在小鼠和结核病患者的尿液中检测LAM，证明了尿液中的LAM可能是识别活动性肺结核的生物标志物［20］。2003年，Chemogen公司首次开发了用于尿LAM测试的酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒，Inverness公司随后将其商业化。2010年，第一个LAM即时诊断测试Alere Determine TB-LAM Ag（AlereLAM，美国雅培公司）试剂盒问世［21］。为了克服AlereLAM敏感性仅为中等的局限性，日本开发了新一代的Fujifilm SILVAMP TB LAM（FujiLAM，日本富士公司）测试。FujiLAM结合了基于银的扩增步骤和MTB特异性LAM表位高亲和力单克隆抗体，可以检测到比目前WHO推荐使用的AlereLAM更低浓度的LAM［22］。近期，我国研究人员基于化学发光免疫法开发的用于LAM检测的试剂盒已获发明专利［23］，但目前，AlereLAM仍是唯一一种商业上可用的尿LAM测试。WHO报告指出，目前可用的LAM检测敏感度较低，不适合作为所有人群的结核病诊断测试。但在HIV感染者中，LAM敏感度较高，尤其是在CD4细胞计数较低的患者中，结核病的诊断准确性非常高。2015年，WHO建议在符合筛查标准的情况下，对HIV阳性住院患者进行侧流尿脂阿拉伯甘露聚糖试验（LF-LAM）检测（即AlereLAM）以减少结核病的发病率和病死率，并于2019年对相关政策进行更新（表1）［24］。
2.与 NTM 的交叉反应可能导致LAM假阳性结果：与非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）的交叉反应导致LAM假阳性结果已在多项研究中进行了报道［25，33, 34, 35, 36］。AlereLAM的测定并不区分分枝杆菌的类别，这使得LAM测定具有非特异性［25］。Nel等［33］回顾了播散性NTM感染的PLWHA受试者AlereLAM检测结果，在评估的1 687例住院患者中，26例受试者被诊断为播散性NTM感染（鸟分枝杆菌21例；堪萨斯分枝杆菌3例；细胞内分枝杆菌2例）。在排除确诊的MTB合并感染受试者后，21例播散性NTM感染受试者中有19例受试者AlereLAM结果阳性。尽管研究未能充分诊断MTB-NTM合并感染且因其回顾性的性质存在一定偏倚，但研究结果仍提示我们播散性NTM可能导致LAM结果假阳性。Bjerrum等［34］的研究发现，27例受试者中2例FujiLAM 阳性受试者分离出缓慢生长的NTM。对FujiLAM中使用的抗体的分析研究中未观察到对快速生长的NTM的交叉反应性［37］，这提示我们PLWHA 中缓慢生长的NTM可能会影响FujiLAM测试结果降低其特异性。在判定播散性NTM是造成尿LAM的阳性结果的原因之前，研究需严格排除MTB和MTB-NTM混合感染［36］。此外，积极探索与MTB有特异性但与快速或缓慢生长的NTM无交叉反应性抗原表位以改进LAM测定方法，是提高LAM诊断准确性的有效方法。3.冷冻尿液和新鲜尿液在LAM中的效用：研究发现，临床上未能及时检测进行冷冻处理的尿液样本，随着冷冻时间的推移，其蛋白质含量和pH值改变导致的尿液碱化可能会影响到LAM测试的性能。此外，新鲜尿液中可能含有更多可检测的LAM，在一定程度上提高测试的敏感度［38］。Connelly等［39］使用ELISA测定了聚对苯二甲酸乙二醇酯管中冷冻至-70 ℃前后尿液样本（n=15）中LAM的浓度，研究发现在样品被冷冻至少1 d后，LAM的平均浓度从138 pg/ml（标准差：99）降至76 pg/ml（标准差：77），建议在进行LAM检测时，使用新鲜尿液样本进行评估。但Broger等［40］使用新鲜尿液样本和冷冻储存的生物库尿液样本探讨FujiLAM结核病测试的结果发现，FujiLAM表现出了良好的稳定性和可用性，使用冷冻储存的生物样本库标本得到的结果几乎与新鲜标本相同。目前，缺乏有关冷冻尿液和新鲜尿液在LAM中效用的研究，在临床检测条件允许的情况下，建议使用新鲜尿液样本进行检测。同时开展相关研究，以进一步分析不同的保存条件是否是造成研究异质性的主要原因。三、基于非尿液样本的LAM检测
（一）基于血液LAM检测尽管早期研究已表明血液中也存在LAM，但目前的血清学检测尚未提供足够的临床准确性，相较于基于尿液的LAM检测，用于结核病诊断的血液LAM检测相对较少［41］。Broger等［42］使用电化学发光免疫测定法对结核病患者尿液和血清进行LAM测试，结果显示尿液和血清的敏感度分别为93%和55%，总体特异度均≥97%，使用现有的方法，尿液LAM测试的准确性更高。Brock等［43］基于分子免疫阵列技术（single molecule array，SimoA）开发的血清 LAM检测技术结果显示，使用2.3 pg/ml的临界值表示100%的特异度时，所有TB+受试者检测敏感度为37%（95%CI：27%~48%），TB+/HIV+受试者检测敏感度为47%（95%CI：34%~61%）。尽管总体敏感度较低，但该研究仍为血清中检测LAM提供了有力的数据支撑。Jakhar等［44］发现，在人类血液中LAM与宿主脂蛋白胆固醇（如：高密度脂蛋白胆固醇）有关，将LAM与高密度脂蛋白胆固醇分离可能有助于血液LAM的检测的开发与应用。目前的研究表明，血清LAM检测仍是一种有前途的结核病诊断方法，但需要进一步工作以优化其检测效能。（二）基于呼出气冷凝液LAM检测分析患者呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）的LAM样本可能是一种潜在的结核病诊断方式。EBC是将呼出气体进行冷凝获得的液体，其收集容易，费用较低且无需专业人员参与，可反映气道内壁液体的组成，因此可能含有来自感染因子或受感染宿主组织肺部疾病特异性标志物，是一种潜在的、非侵入性的诊断样本［45］。通过分析肺结核患者与对照组的EBC样本发现，基线时结核病患者的EBC中检测到15~120 μg/ml的LAM，患者每天呼出约0.3~2.9 mg的LAM。在64 ng/EBC的阈值下，受试者工作曲线分析的敏感度为93.4%，特异度为100%，EBC中存在MTB特异性脂质、LAM和蛋白质，可有效区分基线肺结核患者与对照组［46］。目前评估EBC样本和AlereLAM测试诊断结核病效能的研究正在进行中，基于EBC将LAM与MTB特异性脂质相结合可能是早期诊断结核病的潜在非痰液检测方法。四、小结与展望
LAM作为一种简便、快速的非痰液床旁检测，在结核病的诊断中表现出了良好的诊断前景，特别是在PLWHA结核病的诊断上，LAM克服了PLWHA结核病患者因缺少痰液样本或细菌载量低等造成传统诊断敏感度降低的困境，具有较高的诊断价值。在LAM非痰液检测样本中，相较于血液、呼出气体等样本，尿液LAM因其易于获取、处理和储存以及样本采集时的低感染风险等优势受到广泛关注，目前WHO推荐使用基于尿液样本的AlereLAM辅助诊断肺结核。然而，尿LAM检测用于PLWHA结核病诊断仍存在许多有待解决的问题。例如：（1）为克服AlereLAM敏感度欠佳从而开发的FujiLAM尚未商业化；（2）与WHO为基于生物标志物的非痰液快速检测设定的最低阈值相比，FujiLAM和AlereLAM的敏感度和特异度都有待提高；（3）FujiLAM不同批号之间的诊断准确性存在较大差异；（4）如何解决NTM 之间的交叉反应可能导致LAM假阳性结果问题；（5）冷冻尿液和新鲜尿液是否是造成LAM检测效应不同的影响因素等。为实现LAM临床的广泛应用，仍需不断研发并改进相关检测技术，加大样本量进行更多的研究验证以提高LAM诊断准确性，这将有助于早期筛查PLWHA人群，控制其病情发展、降低病死率。参考文献（略）