本文来源：白血病·淋巴瘤, 2024,33(4) : 193-198.
荧光原位杂交（FISH）技术是基于碱基互补配对原则，利用荧光标记的核酸探针，对待测标本DNA序列进行定位、定性和定量分析的技术，是遗传学异常的主要检测手段之一。相较于核型分析，FISH技术具有快速、灵敏度高及特异性强的优势，是血液肿瘤诊断和预后判定的重要手段。为进一步规范FISH技术在血液肿瘤中的应用，中国抗癌协会血液病转化医学专业委员会、中国老年医学学会病理学分会及中华医学会血液学分会组织国内血液学、病理学和检验学专家，制定了FISH在血液肿瘤中的应用规范。
1 FISH在血液肿瘤诊疗中的应用价值
1.1 诊断分型
遗传学改变是血液肿瘤诊断分型的主要依据。急性白血病（AL）、慢性粒细胞白血病（CML）、伴嗜酸粒细胞增多和酪氨酸激酶基因融合的髓系/淋系肿瘤（MLN-TK）、骨髓增生异常综合征（MDS）、大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤（FL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、伯基特淋巴瘤（BL）、边缘区淋巴瘤（MZL）、间变大细胞淋巴瘤（ALCL）、T幼淋巴细胞白血病（T-PLL）等均需要借助FISH检测关键的遗传学异常才能精准分型。
1.2 预后分层
目前针对急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、MDS、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、原发性骨髓纤维化（PMF）、多发性骨髓瘤（MM）等血液肿瘤，世界卫生组织（WHO）、美国国立综合癌症网络（NCCN）指南已提出了基于遗传学异常的预后分层/评分体系。FISH检测在血液肿瘤的预后评估中发挥着不可替代的作用。
1.3 指导治疗
CML患者中费城染色体（Ph染色体）或BCR：：ABL1融合基因的发现开启了酪氨酸激酶抑制剂（TKI）靶向治疗的新时代。此外，针对PML：：RARA融合基因或其他RARA重排的全反式维甲酸和砷剂、ABL信号通路（ABL1、ABL2、PDGFRA、PDGFRB重排）的TKI药物、JAK-STAT信号通路（CRLF2、JAK1/2/3重排）的JAK抑制剂、FLT3重排的FLT3抑制剂、ALK重排的ALK抑制剂等均已正式应用于临床治疗或处于临床试验阶段。
2 FISH在血液肿瘤诊疗中应用的基本流程
2.1 检测项目选择
依据WHO、NCCN、中国抗癌协会、中华医学会等国内外机构发布的血液肿瘤诊疗指南、专家共识及权威文献报道，表1列出了不同类型血液肿瘤在诊断、预后及治疗方面的必要FISH检测项目，及条件允许的情况下可选择的其他建议项目。
2.2 标本选择
大多数血液肿瘤（AL、MDS、MPN、MM）患者首选骨髓；淋巴瘤患者首选原发部位的淋巴结或病变组织；有骨髓或外周血浸润的无肿块者可选择骨髓或外周血；CLL等明显伴外周血受累的患者可选择外周血。
2.3 检测流程
2.3.1 标本前处理
2.3.1.1 骨髓/外周血标本
（1）低渗：0.4% KCl溶液预热至37 ℃低渗处理20～40 min，使细胞体积变大，有利于杂交信号的分散。时间过长会导致细胞破裂，时间过短易导致杂交信号随机叠加造成假阳性。（2）固定：使用10%体积的固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）预固定，之后重复固定2～3次。（3）细胞悬液：推荐（3～4）×107/ml的细胞悬液浓度，浓度过低导致可供分析的细胞数量不足；浓度过高导致细胞叠加，杂交背景增多，同时细胞拥挤使核内探针信号分散不佳，干扰信号判读。当细胞较少时，可用3～5 μl细胞涂布在指定区域。（4）柠檬酸钠缓冲液（SSC）：2×SSC 37 ℃处理30 min，中和DNA表面负电荷，使细胞染色质更加凝集。（5）脱水：使用梯度浓度的乙醇脱水，如75%、85%、100%乙醇脱水各1 min。
2.3.1.2 分选标本
浆细胞肿瘤患者进行FISH检测前建议使用CD138磁珠对浆细胞进行分选，以提高检出率。分选后的细胞通常较少，推荐使用离心涂片机进行富集和涂片。涂片后将载玻片浸泡于固定液中30 min，后续步骤与骨髓/外周血标本处理相同。
2.3.1.3 组织标本
（1）固定：组织标本离体后采用4%中性甲醛室温固定6～24 h，固定不足或过度都会影响杂交效果。（2）脱钙：骨髓活组织检查或钙化组织病灶使用盐酸脱钙会降解DNA和RNA，推荐使用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙48 h。（3）切片：石蜡组织切片厚度3～5 μm，切片太厚导致信号叠加，切片太薄易造成信号丢失。（4）烤片：烤片温度与时间成反比，高温烤片时间不宜过长，过长导致细胞变形；烘烤不充分则残余的水分可导致组织脱片。（5）脱蜡：建议脱蜡两次，脱蜡不充分会导致杂交信号质量下降。脱蜡剂应1～2周更换一次。（6）预处理：常见的预处理方案有1 mmol/L硫氰酸钠在80 ℃下浸泡20～30 min；30%亚硫酸氢钠在pH值7.0的2×SSC中45℃浸泡20 min；10 mmol/L pH值6.0柠檬酸缓冲液在80 ℃下浸泡30 min至2 h；95 ℃水浴45 min。预处理可去除甲醛浸泡产生的蛋白交联，提高杂交效率。（7）蛋白酶处理：常用的蛋白酶有胃蛋白酶和蛋白酶K，处理时间应视组织的类型、厚度适当调整。处理不足，蛋白质残留过多，降低杂交信号，且蛋白质可能产生自发光，干扰信号判读；处理过度会破坏细胞结构，导致组织脱片。（8）脱水：使用梯度浓度的乙醇脱水，如75%、85%、100%乙醇脱水各1 min。（9）杂交区域选择：镜下观察对应HE染色玻片上的肿瘤细胞分布情况，选择肿瘤细胞数量可满足分析要求的区域为杂交区域并标注。
2.3.2 杂交及清洗
杂交分为变性和退火两个步骤。（1）变性：可分为分离变性和共变性两种。分离变性即探针和标本分别变性。目前实验室普遍使用共变性，即探针和标本同时变性，72～85 ℃，2～10 min；（2）退火：依据探针的种类可设置不同的退火条件，常用的退火温度为37 ℃ 16～18 h，但一些含α卫星DNA等高度重复序列的探针（如着丝粒探针），推荐42 ℃退火，并缩短退火时间，从而减少非特异性结合；对于位点探针，可适当延长退火时间。
注意事项：（1）杂交过程中应防止干片导致杂交信号质量下降。除密封外，可在杂交装置内加入浸水的棉条或纸条来保持一定湿度。（2）盖玻片面积与探针使用量成正比，应根据实验要求、标本特点等因素调整盖玻片大小，通常可按2～5 μl探针/100 mm2计算。
杂交后清洗的目的是去除未结合和非特异性结合的探针。推荐清洗条件如下：0.3% NP40+0.4×SSC，72 ℃，2 min；然后0.1% NP40+2×SSC，室温，1 min。SSC的浓度越低，杂交特异性越强，但信号强度越弱；浓度越高则反之。
2.3.3 染色
加对比染色剂之前，标本必须要充分晾干，否则信号易淬灭。常用的对比染色剂是4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），DAPI产生蓝色光，常用的探针荧光素发射光为红色、绿色及青色，DAPI不会对这3种色光造成干扰；另一种可选的对比染色剂是碘化丙啶（PI），PI产生红色光，与绿色光发生强烈对比，适合作为绿色荧光素的对比染色剂。一些商业化探针还会在对比染色剂中加入抗褪色成分，从而延缓探针荧光素的猝灭。
2.4 结果分析
2.4.1 阅片规则
需双人阅片，阅片时应遵循从左至右、从上至下的原则，不应随机选取视野阅片，易造成部分细胞的漏读或重复判读。
组织切片计数前应先评估肿瘤细胞的分布情况，呈灶性分布者计数应局限于此区域内；呈弥漫性分布者可全片计数。骨髓/血液标本计数时，尽量选取分布均匀、信号质量高的细胞进行计数，避免分析重叠、拥挤、信息不全的细胞。
2.4.2 细胞计数量
不同类型的标本应规定最小的细胞计数量，骨髓/外周血标本计数500个细胞，组织切片及分选标本计数200个细胞。
2.4.3 判读注意事项
融合探针：单信号点基本重合才能判定为阳性信号；有小片段插入时，需使用单色荧光通道观察确认。分离探针：信号点之间的距离需大于单信号点大小的2倍及以上才可判定为阳性；有小片段丢失时，需使用单色荧光通道观察鉴别。缺失探针：如有部分片段缺失，需仔细观察信号点大小，以防误判，必要时应进行分子生物学检测确认是否为有效片段缺失。扩增探针：应结合核型分析，区分多倍体与异常扩增。
2.4.4 报告发布
报告中除患者基本信息、标本信息、申请信息、报告时间及署名等一般信息外，还应包括阈值、计数细胞数量、检测方法；结果应按照人类细胞基因组学国际命名体系（ISCN）进行描述；结论宜简洁明了，易于理解；应对检测项目及结果的临床意义等做适当的解释；还应对相关专业术语进行解释说明。
3 FISH在血液肿瘤诊疗中应用的质量控制
完善的质量控制体系是保证检测结果及时准确的前提。FISH的质量控制首先应满足《医疗机构临床实验室管理办法》《医学检验实验室基本标准（试行）》《医学检验实验室管理暂行办法》《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》等国家通用要求，同时参考IS015189医学实验室认可及美国病理学会（CAP）认证相关文件，建立并运行有效的质量管理体系，在检验前、检验中及检验后的各个环节设立严格的质量控制标准，并对可能影响检测结果准确性的因素进行评估和规定，包括但不限于人员能力评估、设备维护保养、试剂批次验证、性能验证/确认、环境监控等，同时还应定期参加室间质评/比对项目。
3.1 性能验证/确认
每个项目正式开展临床检测前，均应进行性能验证/确认，至少包括阈值建立、方法符合率、分析敏感性及特异性。当主要检测系统发生改变或实验室环境发生较大改变时，应重新进行性能验证/确认。
3.2 对照设置
每台杂交仪每批次实验应设置阳性及阴性对照。对照标本可选已检标本，对照标本应包含此台杂交仪内的至少一种探针，尽量避免每次实验均选择同一种探针。如无法满足时，可选用同一类型的探针替代。
3.3 阈值建立
可参考行业相关指南共识建立的阈值，也可选用实验室自建阈值。自建阈值通常选取20份阴性标本，计数每份标本阳性信号百分比，计算平均值+3倍标准差即该探针的阈值。不同类型的阳性信号、不同的标本类型应分别设置阈值。阈值建立后应每年对其有效性进行评估。
4 总结
本应用规范阐述了FISH在血液肿瘤中应用的临床价值及检测要点，以期进一步标准化FISH技术在血液肿瘤中的应用，为临床诊疗提供帮助。随着检测技术的进步，该应用规范将进一步修订。
执笔专家 王欣、卢朝辉、汝昆、金洁、贡铁军、蔺亚妮
专家组成员（按姓氏汉语拼音字母排序） 鲍立（北京积水潭医院）、曾成武（暨南大学医学院血液病研究所）、常晓娜（华中科技大学附属协和医院）、陈洁平（陆军军医大学第一附属医院）、陈苏宁（苏州大学附属第一医院）、崔海燕（淄博市肿瘤医院）、丁伟（浙江大学附属第一医院）、窦立萍（解放军总医院）、封丽丽（山东省肿瘤医院）、冯献启（青岛大学附属医院）、傅建新（苏州大学附属第一医院）、贡铁军（哈尔滨市第一医院）、郭晓静（天津医科大学肿瘤医院）、何妙侠（海军军医大学第一附属医院）、侯健（上海交通大学附属仁济医院）、侯英勇（复旦大学附属中山医院）、黄传生（江西省肿瘤医院）、黄慧强（中山大学肿瘤防治中心）、黄健（浙江大学附属第一医院）、黄文荣（解放军总医院）、江倩（北京大学人民医院）、姜玉杰（山东第一医科大学附属省立医院）、金洁（浙江大学附属第一医院）、克晓燕（北京大学第三医院）、蓝梅（广西壮族自治区人民医院）、李杰（河北省人民医院）、李青（常州第一人民医院）、李晓玲（天津医科大学肿瘤医院）、梁爱斌（同济大学附属同济医院）、蔺亚妮（天津见康华美医学诊断中心）、刘生伟（哈尔滨市第一医院）、刘艳辉（广东省人民医院）、刘宇（哈尔滨市第一医院）、卢朝辉（北京协和医院）、陆佩华（北京陆道培医院）、路瑾（北京大学人民医院）、马骥（山东省肿瘤医院）、马军（哈尔滨血液病肿瘤研究所）、糜坚青（上海交通大学附属瑞金医院）、聂秀（华中科技大学附属协和医院）、彭军（山东大学齐鲁医院）、戚基萍（哈尔滨医科大学附属第一医院）、任金海（河北医科大学第二医院）、汝昆（山东省肿瘤医院）、施菊妹（上海市第十人民医院）、田素芳（武汉大学中南医院）、王方寒（淄博市肿瘤医院）、王侃侃（上海交通大学附属瑞金医院）、王彤（北京陆道培医院）、王伟（青岛大学附属医院）、王欣（山东第一医科大学附属省立医院）、吴德沛（苏州大学附属第一医院）、徐海苗（浙江省肿瘤医院）、杨少斌（天津见康华美医学诊断中心）、张敬宇（河北医科大学第二医院）、张声（福建医科大学附属第一医院）、张曦（陆军军医大学第二附属医院）、张翼鷟（中山大学肿瘤防治中心）、赵苗青（山东省肿瘤医院）、郑沁（华西医院）、钟玉萍（青岛市市立医院）、周晓燕（复旦大学附属肿瘤医院）、朱明华（海军军医大学第一附属医院）
本文编辑：郎华
