文章信息
发表期刊：Plant Physiology
影响因子：37.2
中科分区：生物学1区
发表时间：2024.01.13
研究背景
侧根形成（LR）和转录因子调控：侧根形成（LR）对于植物吸收水分和养分至关重要，包括三个阶段：侧根原基的起始LRP、LRP的生长和LR的出现；上述阶段会受到LBDs/ASLs转录因子的调控，LBD参与侧枝器官边界的建立，LBD会特异性靶向调控下游靶基因，靶向调控细胞的核迁移和不对称分裂，以及细胞壁的水解，这个过程中会有植物素的参与（生长素等）。转录因子PpLBD16调节LR的形成：PpLBD16已经被证明参与桃根系发育并调节LR的形成，但PpLBD16引发的下游分子事件尚不明晰。
图1 LBD TF调控植物发育的分子机制
研究思路&研究设计
Originegene
本研究采用DAP-seq和RNA-seq等多组学联合分析证实转录因子LBD16在维管植物中会参与侧根的形成和发育调控；RNA-seq结果显示：LBD16主要调控细胞壁合成和降解、离子运输、离子结合及稳态等相关基因的表达；DAP-seq结果显示：LBD16主要结合3个顺式作用元件，LBD16主要结合的基因包括细胞壁修饰基因（PpEXPB2和PpSBT1.7）、离子运输基因（PpCNGC1）、以及多酚氧化编码基因（PpPPO）。研究利用DAP-seq和RNA-seq在桃子全基因组中鉴定PpLBD16的靶基因和特异性结合位点；同源过表达和病毒诱导基因沉默技术来证明假设的靶基因位于PpLBD16下游，参与调节LR的形成。
图2 文章研究思路和实验设计
研究结果
1.PpLBD16参与调节LR的形成
研究基于桃37个LBD蛋白序列和拟南芥10个LBD蛋白序列构建了LBD系统发育树，并进行同源转化，证实了PpLBD16的功能与AtLBD16一致，PpLBD16定位于拟南芥根细胞的细胞核上。
拟南芥中PpLBD16的过表达会显著增加LR的数量，促进初生根PR的生长，PpLBD16的表达量和LRs数量和密度成正相关；拟南芥突变体（arlbd16）的LR数量和密度显著降低。桃根中同源过表达PpLBD16,提高桃的生根率（ AR和LR均有显著升高），反之沉默会降低桃的生根率。综上，PpLBD16参与根系发育，并积极调节LR的形成。
图3 PpLBD16正调控LR的形
2.桃根PpLBD16的转录调控网络
研究对桃根的过表达(OE PpLBD16)和沉默（TRV2_ PpLBD16 进行RNA-seq，研究PpLBD16的转录调控网络;通过差异分析，相对于对照组而言，OE组有379个差异基因（234上调，145下调），TRV组有656个差异基因（302上调，354下调）；OE组和TRV组共调控146个差异基因。
PpLBD16多为正向调控LR的形成，因此对PpLBD16正向调控的差异基因进行GO富集分析，其中包括OE组上调的基因和TRV组下调的基因，富集结果显著富集到：细胞壁发育、韧皮部发育等功能。ARS起源于韧皮部，控制ARS形成的基因也参与调节LR的发育。
3.PpLBD16参与细胞壁生物发生、离子/物质运输、细胞增殖和韧皮部发育
根据GO富集结果显示：PpLBD16显著调节细胞壁和各种生物膜相关的差异基因，使用cytoscape可视化了与细胞壁、细胞膜、细胞增殖和韧皮部相关的差异基因，结果表明，29个差异基因与细胞壁相关；这些差异基因主要包括细胞壁合成相关基因PpXTH2/22和GALACTU、PpXUT1、PpEXPB2等；
综上， PpLBD16表达的改变改变了桃根细胞壁的生物合成和分解代谢，影响了桃根细胞内物质的合成和运输，调节了根组织的细胞增殖。
图5 GO富集网络图
4.PpLBD16下游核心基因分析
筛选了对OE和TRV均有应答的基因，筛选到了8个PpLBD16正向调控差异基因，10个PpLBD16负向调控基因。
DAP-seq结果显示：PpLBD16结合的峰27421个，涉及12622个基因（多为TSS附近），使用MEME-chip识别peak，识别出的前三个显著基序为MEME-1/MEME-2/ABR1。
DAP-seq和RNA-seq联合，23个DEG（定量趋势一致的基因：8正，3负，12OE上调TRV下调）其中13个基因的启动子或5’UTR区域可以被PpLBD16结合，6个基因含有重要的基序均为MEME-2。
图6 DAP-seq技术对PpLBD结合位点进行全基因组鉴定
这四个可能的靶基因中，PpEXPB2和PpSBT1.7与细胞壁相关，PpCNGC1与膜相关。
PpEXPB2、PpSBT1.7、PpCNGC1和PpPPO受到PpLBD16的正调控，这些基因很可能是PpLBD16的直接靶标。
图7 结合RNA-seq、DAP-seq和RT-PCR分析筛选PpLBD16的核心基因
实验验证
对桃幼苗进行根段取样，根被划分为6个区域：根尖、LRP发育、LRP出芽、LRP伸长、LR发育成熟、PR区域，代表了LR发展的不同阶段。定量分析结果显示，PpLBD16（包括4个靶向基因）在根尖和LRP发育区域高表达，在LRP发育过程中显著高表达，LR出现后，其表达量显著降低，上述发现表明PpLBD16参与了桃LRP的萌发和分化。
综上，PpLBD16与4个靶基因一起共同参与桃LRP的发育。
图8 桃根中PpLBD16和4个靶基因的定量数据
研究结论&结果讨论
LBD16对根系的生长尤其是LR的形成至关重要，LBD16作为ARF7/19的下游靶基因，介导生长素调控LR启动；上游调控机制模型已构建相对完善；下游的转录调控网络和靶基因模型需要进一步完善。
对桃的研究中发现，PpLBD16与拟南芥中的AtLBD16同源，都属于IB类LBD；LBD16是IB类IIIA亚类的成员，对LR和伤口诱导的根形成至关重要；除了调节LR的形成，LBD16还参与AR的产生，PpLBD16的过表达促进了桃子AR的形成，沉默则是抑制；综上表明PpLBD16在桃子根生长中的关键功能是保守的。
LR的形成包括定位、起始、生长和涌现；这些过程需要积极的代谢活动来支持细胞增殖；LR的出现需要LRP穿过覆盖的细胞，包括邻近的内胚层，皮层和表皮。这个过程中依赖于细胞壁的软化和修饰；RNA-seq数据显示，PpLBD16正向调节的差异基因与细胞壁和各种生物膜密切相关，参与细胞壁的生物合成和降解、离子/物质转运和离子稳态/结合等。
参考文献
Wu, Xuelian, et al. “Transcription Factor LBD16 Targets Cell Wall Modification/Ion Transport Genes in Peach Lateral Root Formation.” Plant Physiology, vol. 194, no. 4, Mar. 2024, pp. 2472–90. 7.4, https://doi.org/10.1093/plphys/kiae017.
