作者：王乐乐 刘松涛 唐神结 李佩波

单位：重庆市公共卫生医疗救治中心结核病研究室；重庆市公共卫生医疗救治中心；首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所；重庆市公共卫生医疗救治中心结核病研究室

引用本文: 王乐乐, 刘松涛, 唐神结, 等. 抗结核药物性肝损伤的新型生物标志物研究进展 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2024, 47(5) : 469-474. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20230915-00161.

摘要

抗结核药物性肝损伤（ATB-DILI）是结核病患者在抗结核治疗过程中最常见的不良反应。目前ATB-DILI的诊断主要依赖于转氨酶等传统生物标志物，但这些指标对肝毒性特异性低，不能解释肝损伤机制，无法预测ATB-DILI的早期发病。本文通过ATB-DILI早期预测、严重程度预测以及治疗和预防三个方面，对目前有潜在前景的ATB-DILI生物标志物作一阐述。抗结核药物性肝损伤（anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI）是结核病患者在抗结核治疗过程中最常见的不良反应，占药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）的21.99%［1］。抗结核药物也是我国DILI的最常见原因，占26.6%［2］。ATB-DILI不仅可引起肝功能异常，还可能导致肝衰竭，甚至死亡，使治疗中断、治疗时间延长、治疗成功率降低、住院率增加［3］，亦加重患者经济负担。目前ATB-DILI的诊断主要依赖于丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）等传统生物标志物，对ATB-DILI的诊治和预防具有积极的意义。但这些指标对肝毒性无特异性，其水平易受其他因素影响（如过度运动、肌肉疾病和年龄等［4, 5］），亦不能充分解释肝损伤的机制，更无法预测早期发病。因此，寻找新的、诊治和预后价值更高的ATB-DILI生物标志物势在必行。理想的生物标志物应具备高度的特异性、敏感性和稳定性，可区分严重程度、鉴别分型，准确提供风险分层、预后信息，确定损伤机制，且创伤小、样本易获取。因此，本文通过ATB-DILI早期预测、严重程度预测以及治疗和预防三个方面，对目前有潜在前景的ATB-DILI生物标志物作一阐述。

一、ATB-DILI预测相关的新型生物标志物

1. 谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）：GLDH是线粒体功能障碍的特定生物标志物。其水平随DILI的发生和停药，迅速升高或降低，可早期识别并作为DILI的“实时”监测器。与ALT和AST相比，GLDH不受年龄、性别或肌肉损伤的影响，是肝细胞坏死更敏感的预测因子［3，6, 7］。但GLDH诊断抗结核药物所致肝损伤特异性、阳性预测值均较低。GLDH与FECH联合应用可显著提高抗TB-DILI的特异性和诊断准确性，并降低假阳性率［8］。因此，GLDH仍有成为抗结核药致肝损伤诊断生物标志物的潜力，其联合应用尚需进一步研究。2. 炎症介质：DILI中先天免疫相关细胞因子的高水平表达与预后不良相关，而适应性细胞因子的高水平表达与良好的长期预后和患者最终康复相关［9］。最近有研究［10］对活动性结核病患者治疗前后炎症因子监测发现，白细胞介素6（IL-6）、干扰素诱导蛋白（IP-10）巨噬细胞激活标记物（sCD163、CD206）是ATB-DILI的危险因素；白细胞介素22结合蛋白（IL-22BP）、IP-10和sCD163是ATB-DILI的独立危险因素；而IL-22BP是ATB-DILI保护性预测因子。对于ATB-DILI高风险人群，炎症因子可能成为早期诊断、治疗和预测的生物标志物。但目前与ATB-DILI相关的敏感炎症生物标志物仍然稀缺。3. 长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）：lncRNA与转录因子密切相关，对蛋白表达有很强的影响，在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等多种生命过程中发挥重要作用。多种lncRNA已被证实参与肝细胞炎症、凋亡、自噬等过程的调控，并在DILI时发生异常表达［11］。李响等［11］的研究显示，ATB-DILI患者外周血中46种lncRNA表达显著上调，其中上调倍数最大的lncRNA MALAT1、HNF1α-AS1、XIST、CCAT1对ATB-DILI具有较高的预测价值。该研究为ATB-DILI机制研究提供了新的思路，也为发现新的标志物提供了依据。因此，进一步了解lncRNA在肝脏病理生理状态中的作用，有助于开发更好的ATB-DILI诊断和治疗方法。4. 核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）：NF-κB（转录因子蛋白家族）蛋白可选择性与B细胞κ-轻链增强子结合，参与调控多种基因表达；在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中发挥关键作用。NF-κB在发生DILI时被激活，调节炎症信号通路，有助于肝脏稳态和损伤愈合［12］。Zhang等［12］的研究首次揭示了中国汉族人群 PXR和NF-κB1基因（关键基因）多态性与ATB-DILI易感性相关，PXR rs3814055的T等位基因与ATB-DILI风险降低显著相关，NF-κB1 rs78872571和rs4647992的T等位基因与ATB-DILI风险增加显著相关（P均<0.05）。不过，由于样本量限制，PXR和NF-κB1变异体图谱尚需进一步验证，探索PXR和NF-κB信号通路在ATB-DILI发展中的重要作用具有重要意义。ATB-DILI的常规治疗药物异甘草酸镁最近被发现可显著降低一线抗结核药物诱导的肠道通透性和NF-κB mRNA 表达，抑制NF-κB信号通路激活，有效改善ATB-DILI［13］。此外，干酪乳杆菌可能通过调节肠道微生物群和TLR4-NF-κB-骨髓分化因子88途径对ATB-DILI产生保护作用［14］。由此可见，基于NF-κB信号通路可能为治疗ATB-DILI提供新的视角。5. 人类白细胞抗原（HLA）：部分HLA基因型已被证实与ATB-DILI密切相关［15, 16］。Nicoletti等［17］发现了一种罕见的HLA-C*12：02 HLA-B*52：01单倍型是ATB-DILI的危险因素，且HLA-B*52：01等位基因比C*12：02对ATB-DILI的预测效果更显著（P<0.001）。Li等［18］的研究首次证实，HLA-B和HLA-DQB1的5-mC、5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）水平与ATB-DILI显著相关（P<0.01）；5-hmC水平比5-mC水平具有更高的敏感性和特异性，诊断价值更高。因此，5-hmC可以作为新的表观遗传标记物。HLA等位基因对DILI敏感性的预测价值虽然是目前的研究热点，但由于阳性预测值低、筛查成本高，限制了其应用。尽管如此，基因分型还是有助于排除某些特定药物引起的肝损伤，或者当患者联合用药时识别致病药物；在与其他肝脏疾病进行鉴别诊断时，还可避免肝活检等侵入性操作给患者带来的痛苦和风险。因此，HLA等位基因检测仍有望成为ATB-DILI的常规辅助检查方法。6. 线粒体 DNA（mtDNA）：异烟肼代谢物改变了线粒体作为细胞活性氧稳定剂的功能，导致肝细胞丧失对乙酰肼和肼的解毒能力［19］；异烟肼与利福平合用可导致线粒体氧化应激增加，肝细胞坏死［20］。这些结果均证实了线粒体是ATB-DILI发生的关键靶点。mtDNA含量与线粒体功能障碍、氧化损伤和肝脏疾病密切相关，并可能成为一种特定的ATB-DILI预测生物标志物。有研究［21］显示，与健康人比较，结核病患者mtDNA水平更高（P<0.000 1），并且高水平mtDNA与ATB-DILI易感性显著相关（P<0.000 1）；ATB-DILI患者治疗1~7 d内mtDNA水平增加与治疗8~60 d内AST和ALT水平升高独立相关（P<0.01）。因此，mtDNA是比血清转氨酶更敏感的诊断指标，并可作为ATB-DILI高风险的潜在分层工具。7. B 细胞 CLL/淋巴瘤 2（Bcl-2）：Bcl-2可参与自由基生成位点的抗氧化途径、线粒体氧化还原代谢介导的抗氧化过程、促进氧化信号转导并影响活性氧积累；还可将谷胱甘肽定位到线粒体以抑制活性氧产生。作为细胞凋亡和自噬的关键共享分子，Bcl2可以诱发不同类型的肝损伤［22］。Lyu等［23］首次发现中国人群Bcl-2多态性与ATB-DILI的易感性相关。共鉴定出三个有意义的 SNP（rs8085707、rs76986960 和 rs949037），其中rs8085707与ATB-DILI易感性显著相关（P<0.05）。该研究预测模型的成功构建，为深入了解ATB-DILI提供了新的视野，还为新药的开发提供了新的参考依据。基于此，Bcl-2有成为ATB-DILI预测和诊断生物标志物的潜力。8. 基于代谢组学的新型生物标志物：人类微生物生态系统中的微生物在维持宿主免疫、新陈代谢、药物代谢等方面发挥关键作用。ATB-DILI患者尿液微生物群与正常人存在显著差异。Wang等［24］发现阴性球菌和放线菌在ATB-DILI患者尿液中水平显著升高；用药前尿液中葫芦巴碱含量上调与ATB-DILI相关。与轻度 ATB-DILI患者相比，重度ATB-DILI患者可能存在特定的代谢组学和微生物学模式。体内代谢和微生物的变化可用于识别和预测个体对 ATB-DILI 的易感性，并有助于早期识别有严重DILI风险的结核病患者，从而为结核病的个体化治疗提供新思路。另外，脂质组学作为代谢组学的分支，体现了不同生理和病理状态下脂质的变化。研究显示脂质代谢参与了ATB-DILI的发生，脂质变化可能导致ATB-DILI的风险增加［25］。近年来，代谢组学已广泛应用于许多领域的生物标志物鉴定，如植物生物学、毒理学以及疾病发病机制、诊断和预后［26］。但目前代谢组学技术在ATB-DILI领域的应用非常有限，尚缺乏大样本和针对性的前瞻性队列研究，进一步验证各种代谢标志物在识别ATB-DILI易感个体和治疗方面的潜在效用将是未来的研究方向。

二、ATB-DILI严重程度预测相关的新型生物标志物

1.谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）：肺结核患者发生肝损伤后GST水平显著升高（P<0.05），且肝损伤程度越重，GST水平升高更明显（P<0.01）［27］。GST的基因多态性与DILI易感性亦相关［7］。GSTM1无效基因型和GSTP1基因型与ATB-DILI的高风险显著相关［28, 29］；但最近的研究发现，秘鲁人群中GSTM1存在基因型、GSTT1无效基因型具有发生ATB-DILI的显著风险（P<0.05）［30］，这种差异可能与纳入患者的基因-种族以及抗结核药物方案的差异存在潜在联系。目前尚无我国ATB-DILI患者的相关研究。GSTα是GST的同工酶，在检测肝损伤和肝细胞空泡化具有较强的特异性，可减少肝外组织ALT水平的假阳性结果，比AST和ALT更敏感，其基因多态性已被报道与ATB-DILI密切相关［7，31］。2. 高迁移率组框蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）：HMGB1主要在DNA结合和转录调控中发挥作用，肝细胞损伤后被释放到细胞外，与受体结合，产生促进和维持炎症的作用。发生ATB-DILI时HMGB1水平明显升高，并且与传统的N-乙酰半胱氨酸治疗相比，HMGB1中和抗体治疗更有效［32］。HMGB1-RAGE信号通路可能参与了ATB-DILI的发生发展，HMGB1、晚期糖基化终末产物受体蛋白水平与ATB-DILI的严重程度显著相关［33］。因此，HMGB1可能成为ATB-DILI严重程度预测和治疗的生物标志物，通过抑制HMGB1表达，预防促炎反应可能是治疗DILI的有效方法。3. 微小RNA（microRNA，miRNA）：miRNA在体液中相对稳定，参与调节多种肝脏疾病的发生发展，是一系列肝脏疾病的重要治疗靶点。miR-122是一种特定的肝脏生物标志物，约占肝脏miRNA总量的72%［34］。在异烟肼诱导的肝损伤中，miR-122通过调节线粒体核糖体蛋白S11基因影响氧化应激，可能是ATB-DIL的发生机制之一［35］；ATB-DILI严重程度与miR-122/miR-155的相关性比ALT/AST 更显著（P<0.01），表明miR-122/miR-155可作为ATB-DILI的敏感生物标志物，有助于ATB-DILI的早期诊断［36］。另外有研究发现，通过末梢血中的miR-122 水平与血浆和静脉全血浓度显著相关（P<0.000 1）［37］。因此，miR-122具有更敏感、可通过微创方式获得等优点，作为ATB-DILI早期诊断的生物标志物的潜力显而易见，值得进一步研究探索。4. 白细胞端粒：端粒是染色体末端的重复六核苷酸（5′-TTAGGG-3′）序列，对于染色体末端保护（端粒加帽）和染色体稳定性至关重要［38］。细胞分裂时，端粒长度缩短，染色体加帽功能丧失，导致细胞衰老、凋亡和肿瘤转化等，还可加速肝硬化进展［39］。年龄已被证实是ATB-DILI的危险因素之一，而端粒是年龄相关疾病的生物标志物［38］，因此，端粒长度异常可能是肝细胞损伤的重要标志物，为结核病患者早期检测ATB-DILI进展提供机会。Udomsinprasert等［38］的研究首次发现白细胞相对端粒长度（relative telomere length，RTL）：无ATB-DILI的结核病患者<ATB-DILI的结核病患者<健康群体（P<0.01），较长的RTL是ATB-DILI的独立危险因素；并且RTL与抗结核治疗后60天内评估的AST和ALT升高呈独立正相关（95%CI：0.004~0.009，P<0.001）。与传统的肝脏生物标志物相比，RTL的灵敏度和特异度更高，可能是早期预测ATB-DILI进展的潜在生物标志物。5. 基于代谢组学的新型生物标志物：研究发现，抗结核药物联合应用可以显著改变机体代谢特征，服药后患者尿液中胆汁酸水平显著增加［28］。Wang等［40］确定了ATB-DILI与非ATB-DILI患者之间的22种血浆差异代谢物和7个脂质差异代谢物，其中甘氨酰-L-亮氨酸和N4乙酰胞苷与ATB-DILI的发生和严重程度显著相关；药物代谢、烟酸、烟酰胺代谢通路、酪氨酸代谢、色氨酸代谢均与ATB-DILI显著相关；并首次成功建立了ATB-DILI预测模型。表明基于代谢组学相关的新型生物标志物可能为ATB-DILI的临床预测提供价值。

三、ATB-DILI预防或治疗相关的新型生物标志物

1. 环状RNA（circular RNA，circRNA）：circRNA可作为转录调节剂以及与RNA结合蛋白的结合发挥重要作用。circRNA具有通用性、稳定性、特异性、保守性等特点，作为疾病的生物标志物，明显优于线性RNA。Li等［41］发现了ATB-DILI患者的113个差异表达的circRNA，其中circMARS的表达升高最显著（P<0.05），其可能通过circMARS-miR-6808-5p/-6874-3p/-3157-5p-KMT2C-EGFR功能轴，参与ATB-DILI的代偿性修复。炎症浸润是ATB-DILI的主要特征之一，但其机制尚不清楚。去乙酰化酶通过抑制NLR家族Pyrin结构域3的激活而发挥抗炎特性，这对于ATB-DILI治疗至关重要。有研究证实了hsa_circ_0093884（一种circRNA）可通过与ATB-DILI中的核糖体蛋白S3结合调节去乙酰化酶表达，抑制炎症反应，且发生ATB-DILI时hsa_circ_0093884表达水平明显降低［42］。这些研究结果可能为开发ATB-DILI治疗的新靶点提供思路和方向。2. 转录因子核因子红细胞 2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）：Nrf2可调控参与保护肝细胞免受氧化损伤的基因表达，与抗氧化反应元件（ARE）结合，形成Nrf2-ARE信号通路，增强Ⅱ相代谢酶和抗氧化蛋白的表达和转录，涉及NRF2、KEAP1、MAFF、MAFK和MAFG等异位基因，在清除活性氧、保护肝细胞中发挥着至关重要的作用［43］。因此，Nrf2是介导抗氧化基因表达的中央调节因子，也是预防或治疗ATB-DILI的潜在靶点。异烟肼可通过干扰Nrf2的核转运蛋白 karyopherin β1抑制Nrf2的核转位，诱导细胞凋亡［44］。MAFF的高表达有利于其与 Nrf2 结合，使抗氧化酶表达增加并减少ATB-DILI 的发生［43］；MAFK rs3735656则与ATB-DILI 的发生风险显著相关（P<0.001）［45］。慈姑多糖（多糖类）、贯叶蓼总黄酮（黄酮类）、没食子酸（多酚类）等天然药用成分可激活Nrf2/ARE信号通路，上调内源抗氧化剂的基因表达，减轻氧化应激，抑制肝细胞凋亡，保护异烟肼与利福平联合应用引起的肝损伤［46, 47, 48］。丹参酮IIA可介导Nrf2去甲基化，促进Nrf2-ARE信号通路形成以及胆汁转运和胆汁酸排出［49］。以上研究均表明，Nrf2相关的信号通路可能成为ATB-DILI治疗的新靶点，为后续ATB-DILI治疗药物研发提供证据。另外，HMGB1［32］、NF-κB［13, 14］等生物标志物亦被证实与ATB-DILI密切相关，有望成为治疗ATB-DILI的新靶点。随着分子检测方法和基因组学分析技术的发展，ATB-DILI的发生机制进一步强调了上游基因引起的下游事件以及环境和遗传风险因素之间复杂的相互作用。但目前我们对ATB-DILI的遗传基础的了解仍然不够全面。基因组研究除可识别对ATB-DILI风险影响较大的常见变异，还可识别对风险影响显著的罕见变异。常规基因组测序或基因分型，除用于判断发病风险、诊断以外还可用于指导个体化给药。N-乙酰转移酶 2、细胞色素P450超家族（cytochrome P450 proteins，CYP）、GST等药物代谢基因多态性已被正式与ATB-DILI相关［50］。但随着对ATB-DILI研究的深入，寻找更多相关基因，了解其功能作用，将有助于更好地预测ATB-DILI，发掘药物治疗靶点，并设计更有效的个性化抗结核治疗方案。

四、未来的展望和研究

与传统的血清学指标相比，新的分子生物标志物显示出更好的敏感性和特异性。GLDH、GST、miR-122、白细胞端粒和mtDNA等水平在发生ATB-DILI时升高得更快，停药后消除得更快；GLDH 和miR-122在肝脏中含量丰富，不受过度运动和肌肉疾病的影响；药物相关的基因检测除特异性高外还可用于指导个体化给药。这些优点弥补了传统生物标志物的不足。因此，新的分子生物标志物可进一步改善ATB-DILI诊断、预测和风险评估结果。然而，在将这些新的生物标志物应用于临床实践之前，尚有许多障碍需要我们克服。首先，理想的生物标志物应该有助于排除某些特定药物引起的肝损伤，或准确的识别致病药物，但目前的ATB-DILI研究多为联合用药，并且未排除患者的肝脏疾病史；其次，对这些生物标志物的了解来自相对有限的患者群体，尚未深入研究特定的ATB-DILI机制或不同生化模式；再次，除基因检测外，各种肝损伤都可能导致这些生物标志物异常，但基因检测又受时间长、经济成本高的限制；最后，目前的研究主要集中在临床前，临床转化需要更多的时间。因此，未来的研究应该进一步确定新的生物标志物在ATB-DILI机制中的作用，与其他肝脏疾病相比，评估这些生物标志物在ATB-DILI中的表现及其在高危人群中的预测价值并进一步发掘用于治疗的药物靶点和指导抗结核药物个体化治疗。参考文献（略）