文字/编辑：一口半夏
«——【 ·前言· 】——»
蓝细菌是一种产氧光合自养细菌，在细菌中独特地产生硫酸化胞外多糖以支持光合生物膜，而蓝细菌和其他生物体的硫酸化多糖，现在作为一种有益的植物材料受到广泛关注。
但是人们对蓝藻中的生物合成机制和功能知之甚少，于是我们提出了模型蓝藻的集胞藻sp，以此来探究生物合成机制中的秘密。
结果发现其中的PCC 6803 菌株，形成了嵌入硫酸化胞外多糖（称为 synechan）的花状细胞聚集体，从而进一步鉴定出负责 synechan 生物合成及其转录调控的整套基因，最终提出 synechan 生物合成装置的模型。
由于在许多蓝藻基因组中发现相似的基因且变异很大，因此我们的研究结果可能有助于阐明各种硫酸多糖，以及凭借此模型更好的研究其他细胞生物成分。
集胞藻的水华首先我们建立了两步培养制度（2天的鼓泡培养和随后在连续光照下不鼓泡的静置培养），用于可重复地形成花状聚集体。
第一个（冒泡）步骤允许细胞增殖和 EPS 产生，而第二个（站立）步骤允许大量细胞聚集和漂浮，即使集胞藻 6803 不具有细胞内气体囊泡的基因。
然后用膜过滤，从开花的培养物中分离出粗粘性EPS，粗粘性EPS由多糖组成，但蛋白质或核酸很少，其丰度在第二个培养步骤中保持不变。
作为细菌中多种EPS生物合成系统的共同特征，膜结合糖基转移酶尤为重要，在集胞藻6803基因组中，有59个基因被注释为糖基转移酶，其中十二个未被表征，并预测编码跨膜螺旋。
因此我们最初破坏了其中的五个，发现slr5054对于水华形成至关重要，通过在过滤前去除细胞以避免细胞相关的多糖（例如 CPS），改进了粘性 EPS 制备。
Δ slr5054缺乏野生型 (WT) 中存在的大部分 EPS，而 WT 和 Δ slr5054中的 CPS 和游离多糖部分相似，这里需要用阿尔新蓝染色来检查EPS的酸度。
一般来说，硫酸化多糖在pH 0.5条件下染色，而含有硫酸根和/或羧酸根基团（如糖醛酸和羧酸盐修饰）的酸性多糖在pH 2.5条件下染色。
WT 的 EPS 在两种 pH 条件下均明显染色，强烈表明硫酸盐修饰。
用于粘性 EPS slr5054生物合成的基因簇位于大质粒 pSYSM 上的一个大基因簇 ( sll5042–60 )中，我们将其命名为xss (前微量硫酸化多糖生物合成) 。
该簇包括两个磺基转移酶基因 ( xssA、xssE )、八个糖基转移酶基因 ( xssB、xssC、xssG、xssI、xssM、xssN、xssO、xssP），三个多糖聚合系统基因（Wzx/flippase；xssH、Wzy/polymerase；xssF和多糖共聚酶[PCP]；xssK ），一个假定转录调节因子的基因（xssQ），一对细菌双组分磷酸传递系统（xssR，xssS）的基因，以及编码几种功能未知的小蛋白的基因。
除功能未知的基因外，所有基因均用通读盒单独破坏，并通过菌落 PCR 确认分离。
在许多突变体中，水华形成和 EPS 部分的糖含量降低。
特别是，在 Δ xssA、 Δ xssB、 Δ xssF 、 Δ xssH、 Δ xssK、 Δ xssM、 Δ xssN和 Δ xssP中，水华形成被完全消除，其中 EPS 积累也受到抑制。
某些糖基转移酶突变体（Δ xssC、 Δ xssG、 Δ xssI、ΔxssO）形成了水华，但积累了很少的 EPS，并且在一种磺基转移酶突变体（Δ xssE ）中，水华形成和 EPS 积累都没有发生实质性改变。
一般来说，细菌中的Wzx/Wzy系统通过四个步骤产生各种EPS、脂多糖和CPS：（i）通过一系列糖基转移酶和修饰在质膜细胞质侧的脂质接头上生物合成杂寡糖重复单元。
(ii) 通过 Wzx 将单元翻转到周质侧，(iii) 通过 Wzy 将新生多糖链转移到重复单元进行聚合，以及 (iv) 通过周质和外部导出 EPS 链通过 PCP 和外膜多糖ex进入膜端口蛋白 (OPX)。
这表明xss簇很可能包含除 OPX 基因外的一整套 Wzx/Wzy 依赖性途径基因。
硫酸化 EPS 生物合成的调控感觉组氨酸激酶突变体 Δ xssS积累了比 WT 更多的 EPS，而同源响应调节因子xssR和转录调节因子xssQ的突变体，在水华形成和 EPS 积累方面均具有无效表型。
双突变体 Δ xssS /Δ xssR具有与 Δ xssR相似的表型，xssR或xssQ (OX- xssR、 OX- xssQ )的过度表达导致强烈的水华形成以及粘性 EPS 的显着积累，类似于 Δ 中所见的情况xssS。
xssQ破坏和xssR过表达 (Δ xssQ + OX xssR )的组合消除了水华形成和 EPS 积累，而xssQ过表达和xssR破坏 (Δ xssR + OX xssQ )的组合，导致了水华形成和 EPS 积累的显着表型。
这些结果表明传感器组氨酸激酶 XssS 抑制反应调节剂 XssR，导致转录激活剂 XssQ 的激活。
值得注意的是，OX- xssR和OX- xssQ菌株在琼脂平板上形成粘性、非活动性、生物膜样菌落，可以用镊子挑取。
XssQ是一种新型的信号转导A TPase，具有许多结构域（STAND）蛋白，因为它具有N末端螺旋-转角-螺旋转录DNA结合域。
典型的 STAND 蛋白具有具有 ATP 酶活性的三结构域模块，参与动物、植物和一些细菌的细胞凋亡和免疫等过程。
使用实时定量 PCR (qPCR)，我们比较了WT、Δ xssS和 Δ xssQ的xss簇中的基因表达。
五个基因的表达（与 WT 相比，xssA、xssB、xssE、xssN、xssP ) 的 Δ xssQ非常低，而xssF、xssH和xssK则没有受到显着影响。
这些结果表明XssQ 转录激活编码磺基转移酶和某些糖基转移酶的基因，但不激活聚合基因并通过 Wzx/Wzy 系统输出。
为此对 Δ xssS中基因表达的 qPCR 分析揭示了xssB、xssE、xssN和xssP轻微上调的趋势。
接下来我们进行了 WT、Δ 的 RNA 测序xssS和 Δ xssQ分析转录组，在Δ xssQ中下调和在Δ xssS中上调的基因主要是xss基因。
具体来说调控的基因是xssA-E和xssL-P，与qPCR分析大致一致，从而得出结论，xssA-E和xssL-P受 XssS/XssR/XssQ 特异性调控。
在之前的报告中xssA–xssE和xssL–xssP在集胞藻6803的另一个亚菌株中低温下上调。
为了在亚菌株中测试这一点，我们测量了 20°C 下 WT 培养物的硫酸化 EPS 积累，结果是正常生长温度下的 3.1 倍，该结果表明 XssS/XssR/XssQ 是xss基因表达的温度传感器。
根据差异RNA-seq型转录组分析，比对了受调控基因（xssA、xssE、xssL、xssN和xssP）转录起始位点附近的核苷酸序列，以找到XssQ结合的共有序列，里面有单一或串联共有序列，AAGTTXXAC。
为了确认 XssQ 与该区域的结合，我们使用纯化的重组 XssQ 蛋白和xssE上游的 PCR 扩增 DNA 片段进行了电泳迁移率变动测定 (EMSA)，放射性标记探针 DNA 的条带位置发生变化，反映了 XssQ 的浓度。
这种转变很大程度上是通过过量添加未标记的天然竞争物而消除的，但不是通过添加在共有区域中具有突变的突变竞争物来消除，结果表明 XssQ 识别xssE和其他靶基因转录激活的共有序列。
还需要对WT 和过量生产突变体 (Δ xssS )的 EPS 分数进行化学成分分析。
其中来自 Δ xssS的 EPS 仅由四种类型的单糖和硫酸盐组成，鼠李糖：甘露糖：半乳糖：葡萄糖：硫酸盐的接近化学计量摩尔比为 1:1:1:5:2。
这一发现与基因数量大致相符，即八个糖基转移酶基因和两个磺基转移酶基因。
假设 Δ xssS的硫酸化 EPS是由xss产生的集胞藻 6803 中的簇并指定为“synechan”。
另一方面，除了 Δ xssS的 Synechan 之外，来自 WT 的 EPS 部分可能还含有由甘露糖、岩藻糖和木糖组成的未知多糖。
应该提到的是，膜过滤可以有效地从“游离”多糖中选择性地收集多糖，文献中这些多糖已与粘性分子混合在一起。
在携带Wzx/Wzy系统的OPX蛋白的xss质粒中没有候选基因，而在主染色体上发现了OPX同源物sll1581 ，sll1581 (Δ sll1581 )的破坏消除了水华形成和 EPS 积累。
因此染色体 OPX 蛋白 Sll1581 (XssT) 似乎充当 synechan 的外膜输出蛋白。
有趣的是，集胞藻 6803 在主染色体上拥有xssT（OPX 基因）和sll0923（第二个 PCP-2a 基因），在质粒 pSYSM 上拥有xssK（PCP-2a 基因），而其近亲集胞藻 6714 仅包含sll0923的同源物和xssT ，但缺乏携带xss簇的整个质粒。
这表明 XssT 充当 XssK 和 Sll0923 双重功能的 OPX。
集胞藻 6803 很可能获得了 pSYSM，并借用了染色体 OPX 基因xssT来产生 synechan，或者，集胞藻 6714 可能已经丢失了该质粒。
结论总结这些数据，我们提出了 synechan 生物合成装置的模型，包括 OPX 和温度响应调节。
Xss装置的模型与已知的以野油菜黄单胞菌中的黄原胶生物合成为代表的Wzx/Wzy依赖性装置非常吻合，包括XssP（引发糖基转移酶）在内的八种糖基转移酶产生八个糖的寡糖重复单元，这与synechan的糖组成一致。
这些发现表明， pSYSM 质粒上的xss簇包含除 OPX 基因（ xssT）之外的一整套用于 synechan 生物合成的基因。
值得注意的是，该簇包含两个磺基转移酶基因，但据我们所知在其他用于胞外多糖生物合成的细菌基因簇中尚未发现这两个基因。
研究也发现磺基转移酶XssA和XssE属于不同的细菌磺基转移酶亚家族。
我们通过Pfam搜索（PF00685、PF03567、PF13469）在各种蓝藻基因组中发现了许多磺基转移酶基因，它们主要存在于假定的细胞外多糖生物合成的基因簇中（Wzx/Wzy型和ABC型）。
应该指出的是它们或多或少部分是作为胞外多糖生物合成系统的簇，而xss除了集胞藻 6803 中的 OPX 基因外，该簇似乎是完整的。
众所周知细菌的膜锚定脂多糖和 CPS 的多糖部分是通过 Wzx/Wzy 依赖性或 ABC 转运蛋白依赖性途径产生和输出的，而游离的EPS即黄原胶和纤维素，是通过 Wzx/Wzy 依赖性和合成酶依赖性途径产生的，而不是通过 ABC 转运蛋白依赖性途径产生的。
基因破坏将证实从基因簇分析中推断出的此类预测，尽管由于除集胞藻 6803 之外的转化效率较差，在许多蓝细菌中进行定向破坏并不那么容易，相比之下在其他细菌中没有报道硫酸化多糖
已知其中一些可将硫酰基转移至根瘤菌（Nod 因子）和分枝杆菌中的脂寡糖，为了深入了解运动亚株和非运动亚株之间水华形成的差异，我们比较了转录组数据。
很明显除了主染色体上的xssT外，质粒上的许多xss基因在运动亚系中的表达量比非运动亚系高数倍，尽管xss基因簇的核苷酸序列在它们之间是完全保守的。
这一事实表明通过 XssS/XssR/XssQ 的另一种信号传导可能导致亚菌株之间水华形成和 Synechan 产生的差异。
此外集胞藻 6803 的另一种运动亚株的细胞聚集需要 IV 型菌毛装置，它驱动细胞运动，另一种非运动亚株的细胞聚集也需要 IV 型菌毛，但这种聚集通过 OPX 基因 ( xssT ) 的破坏而增强。
因此细胞聚集和花华形成可能是集胞藻6803中胞外多糖和IV型菌毛的复杂现象。
蓝藻水华在漂浮于水面的蓝藻细胞群中迅速积累，常常产生强效蓝藻毒素（肝毒素、神经毒素等），水华被认为主要由细胞浮力支持，该浮力归因于由气体囊泡。
我们的研究表明，蛋在不添加任何二价阳离子的情况下，气体捕获的 EPS 足以形成集胞藻 6803 的水华，而集胞藻 6803 不会产生气泡。
集胞藻 6803 中 Synechan 的 Xss 依赖性生物合成是研究其他蓝藻硫酸多糖的良好模型。
引用[1]艾伦里特、柯蒂斯：集胞藻的无菌生物膜形成和聚集，PCC 6803 菌株由营养浓度变化诱导，需要细胞表面结构应用和环境微生物学。
[2]海耶斯、普法伊弗沃尔斯比：主要气体囊泡蛋白 GvpA 的序列影响盐细菌气体囊泡的宽度和强度 FEMS 微生物学快报。
[3]贝莱扎、阿尔塔诺、德菲利皮斯：罗马地下两种蓝藻菌株的胞外多糖。
