作者：张玉林 曹彬
单位：中日友好医院呼吸中心呼吸与危重症医学科 国家呼吸医学中心 国家呼吸疾病临床医学研究中心 中国医学科学院呼吸病学研究院
引用本文: 张玉林, 曹彬. 呼吸道感染的病原学检测及其临床应用 [J] . 中华结核和呼吸杂志, 2024, 47(5) : 497-500. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20240227-00109.
经全国继续医学教育委员会批准，本刊开设继教专栏，每年从第1期至第10期共刊发12篇继教文章，文后附5道单选题，读者阅读后可扫描标签二维码答题，每篇可免费获得Ⅱ类继教学分0.5分，全年最多可获5分。
摘要
呼吸道感染性疾病在儿童、老年人和免疫低下人群中发病率高，病死率高，病原学诊断极为关键。然而，呼吸道感染病原复杂，明确病原是临床的难点。传统的呼吸道病原检测方法包括涂片染色镜检法、微生物培养法、免疫学方法等。近几年，分子生物学检测方法包括聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、多重PCR、宏基因组二代测序（mNGS）和靶向基因组测序（tNGS）技术逐渐兴起。每种检测方法各具其优势和不足，因此，临床医生应根据患者疾病病情、免疫状况及影像学表现，选择适当的检测方法，必要时联合多种检测手段进行相互验证，以便做出符合患者病情的正确诊断。呼吸道感染是临床上常见的呼吸系统疾病，是由病原微生物侵入机体呼吸道（鼻、咽、喉、气管、支气管及肺组织）引起的炎症病理改变［1］。其中，下呼吸道感染（lower respiratory tract infections，LRTI）对全球人类健康产生了重大威胁，尤其在儿童、老年人及免疫低下人群呈现较高的发病率和病死率［2, 3］。70岁以上老年人LRTI的病死率极高，每10万人中约有278.1人死亡［3］。LRTI病原体种类较多，涵盖细菌、真菌、病毒和寄生虫，单一病原感染或混合感染均可见［4］。近年来，肿瘤和器官移植患者增多，免疫抑制剂在临床上广泛应用，肺侵袭性真菌（如丝状真菌、隐球菌、肺孢子菌）、非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）感染的发病率有升高趋势，临床诊断存在困难。因此，快速明确呼吸道感染的病原至关重要。传统微生物培养方法是呼吸道病原体检测的“金标准”，然而，由于病毒、非典型病原体、结核分枝杆菌培养要求高、培养周期长且操作繁琐，临床微生物实验室常通过分子生物学检测方法对这些病原体进行鉴定。呼吸道病原体的多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法已广泛应用于临床微生物实验室［5］。然而，该方法可能会漏检不在检测范围内的病原体，目前已有一些检测范围更广的分子检测技术出现，如宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）和靶向基因组测序（targeted next generation sequencing，tNGS）。本文对呼吸道感染病原检测及其临床应用进行了总结。一、传统微生物检测方法
1.涂片染色镜检法：针对呼吸道样本如痰、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等，常用的涂片染色镜检法包括革兰染色、抗酸染色、免疫荧光染色和墨汁染色等，操作简便快速。涂片染色镜检法的用途及建议开展相应项目的医疗机构如表1所示［6］。涂片染色镜检法的不足之处在于：（1）灵敏度较低，难以发现数量较少的病原菌；（2）需检验人员具备一定的工作经验；（3）难以鉴定到种；（4）染色涂片的质量直接影响病原检出率。因此，涂片染色镜检法需与其他检测方法联合使用，提高对呼吸道病原的检出率。
2.微生物培养法：包括痰液或BALF细菌、真菌和分枝杆菌培养，分离培养、鉴定微生物是实验室诊断呼吸道感染病原的金标准。呼吸道微生物培养方法、局限性及建议开展相应项目的医疗机构详见表2。临床医生在涂片镜检的基础上，针对不同病原微生物应选择适当的培养类型和培养方式（培养时间、培养条件等）、鉴定方法及后续的药敏实验，必要时联合其他分子生物学方法进行检测，提高临床的诊治效果。
二、免疫学方法
抗原检测法是指用已知病原体抗体检测患者体内有无相应病原体抗原的方法。常用操作方法有乳胶凝集试验、胶体金免疫层析法等。基于呼吸道微生物抗原检测的方法主要用于呼吸道病毒和肺部真菌感染的诊断。呼吸道病毒（流感病毒和呼吸道合胞病毒等）抗原检测方法价格适中，操作方便、快速、可进行自检，特异度较好，阳性多数可以明确诊断，但其敏感度低于核酸检测，抗原阴性时不能排除该病原感染。肺部真菌感染的抗原检测方法包括隐球菌荚膜多糖抗原试验、1，3-β-D葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖（Galactomannan，GM）试验等。血清隐球菌荚膜多糖抗原检测方法在肺隐球菌病诊断中具有重要价值，特异度较好（99.6%），但敏感度较低（75.0%），阴性不能排除感染［7］。脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性可作为隐球菌脑膜炎的确诊指标。血清与BALF的GM试验用于疑似侵袭性肺曲霉病的诊断，阈值：单次血清/血浆GM值≥1.0、或BALF的GM值≥1.0、或单次血清/血浆GM值≥0.7且BALF GM值≥0.8、脑脊液GM值≥1.0可作为侵袭性曲霉病的阳性诊断标准［8］。血清G试验主要用于疑似侵袭性真菌病（包括念珠菌病、曲霉病、肺孢子菌病等）的辅助诊断，但不用于隐球菌病和毛霉病的诊断，侵袭性肺念珠菌病罕见，多为念珠菌菌血症播散所致，早期G试验可呈阳性，阴性预测值较高［8］。另外，尿抗原检测也可用于诊断肺部感染，如尿液肺炎链球菌与军团菌抗原的检测，操作简便快速，基层及以上医院均可开展，但敏感度较低。抗体检测法是指用已知病原体抗原检测患者体内有无相应病原体抗体的方法。常用操作方法有酶联免疫吸附法等。呼吸道病毒与非典型病原体的抗体（IgM与IgG）检测方法所需时间较长，非特异性蛋白干扰易出现假阳性，同时对于免疫缺陷宿主，易出现假阴性。曲霉特异IgG抗体是检测慢性空洞性肺曲霉病最敏感的方法，也可用于慢性肺曲霉病的诊断和治疗监测，变应性支气管肺曲霉病患者可检测曲霉特异性IgE抗体［8, 9］（表3）。
需要注意的是，免疫学方法用于检测肺部真菌感染时，需结合患者临床症状、体征及其他微生物学指标进行综合判定。三、分子生物学检测法
1.PCR：主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）、环介导等温扩增PCR及数字PCR检测方法。数字PCR可以实现病原微生物的绝对定量。上述方法的优缺点、临床应用场景及其结果解析见表4。
2.多重PCR：主要采用多重引物，针对不同病原体核酸或耐药基因进行特异性扩增，可以同时检测同一样本中的细菌、病毒、支原体等临床常见病原体及其耐药基因。该方法的优缺点、临床应用场景及其结果解析见表4。基于呼吸道病原的多重PCR检测法已有多种商品化试剂盒，特别是目前兴起的快速多重病原核酸检测（POCT），在覆盖病原种类和检测敏感度方面具有明显优势，便于医生更快速地做出准确的诊断和治疗决策，从而提高了呼吸道感染性疾病患者的治疗效果。呼吸道病原流行期间，建议优选POCT进行病原检测［10, 11］。3.mNGS：近年来兴起的mNGS技术是基于高通量核酸检测的微生物鉴定技术，可应用于临床样本病原学的检测。其主要原理是将提取的微生物基因组核酸进行逆转录和（或）扩增，构建好文库并进行上机测序，生成测序数据，由专业人员对测序数据进行分析，最终完成检测结果的报告。mNGS方法对临床病原微生物的快速精确诊治具有较高的应用价值［12, 13］。然而，该技术也存在局限性，其优势、不足、临床应用场景及其结果解析如表4所示［9］。4.tNGS：tNGS是利用大量针对目标基因序列的引物/探针对待测样品中的核酸进行超多重PCR扩增/探针捕获，对其进行高通量测序并进行生信分析，从而明确待测样本中的核酸。tNGS技术可鉴定细菌、真菌、病毒、寄生虫及其耐药基因、毒力基因等［14, 15, 16］。基于tNGS操作便捷且具有高度的置信度和准确性，有望用于呼吸道感染病原的实验室诊断。tNGS技术的优势、不足、临床应用场景及其结果解析如表4所示［16］。四、总结与展望
儿童、老年人及免疫低下人群下呼吸道感染易发展为重症化，病死率较高，因此，早期明确这些人群呼吸道感染的病原体并进行快速有效治疗极为关键。目前呼吸道感染病原体的检测方法有很多种，但每种方法具有适合其应用的临床场景，且均有优势及不足。因此，临床医生需要根据患者状况、疾病特点、实验室条件、可疑病原微生物种类等综合评估，选择针对患者呼吸道感染的经济有效的检测方法。参考文献（略）
问答题（单选题）
1. 墨汁染色主要用于检测（）
A. 念珠菌属
B. 曲霉属
C. 镰刀菌
D. 隐球菌
2. 结核/非结核分枝杆菌可在下列哪种培养基生长（）
A. 巧克力培养基
B. 罗氏培养基
C. 血培养
D. 改良沙氏培养基
3. 下列哪项是错误的（）
A. 多重PCR方法结果阳性时，应结合患者免疫状况及检出病原的致病性等综合判断
B. 呼吸道感染流行期间，建议优先采用POCT进行病原检测
C. tNGS可检测呼吸道多种已知病原
D. 解读mNGS报告时，可将所有列出的微生物作为病原微生物处理
4. mNGS的优势不包括（）
A. 覆盖病原范围广
B. 与传统培养相比，检测周期较短
C. 可同时检测病原体毒力及耐药基因
D. 病原诊断的金标准
5. 呼吸道病毒感染的特异性检测不包括（）
A. 核酸检测
B. 病毒分离培养
C. 抗原检测
D. C反应蛋白检测
