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不孕不育率的上升趋势迫切需要一种可负担且易于获取的不孕不育诊断和治疗方法。辅助生殖技术(ART)的发展增加了生育机会，而高质量精子的分离已被证明可以提高ART的成功率。微流体为ART高通量选择具有更高DNA完整性的运动精子提供了独特的机会。
在这项研究中，来自伊朗塔尔比亚特莫达尔斯大学Mohammad Zabetian Targhi/澳大利亚墨尔本莫纳什大学的Reza Nosrati团队提出了一种高通量蝴蝶形微流控芯片，利用精子流变性和边界跟踪行为分离具有完整DNA和高运动能力的精子。通过20分钟的选择过程，在每毫升410万个精子浓度下，所选精子的质量得到了显著提高，表明该方法在ART和人工授精方法中分离精子是有效的解决方案。
相关研究成果以“High-throughput selection of sperm with improved DNA integrity and rapidly progressive motility using a butterfly-shaped chip compared to the swim-up method”为题于2024年9月24日发表在《Lab on a Chip》上。
1.设备制造和操作
输卵管内折叠的上皮组织提供了微密闭环境，并扰乱了流动，通过趋流性和边界跟踪行为分离出逐渐运动的精子。这些固有特性导致受精，其中两个是趋流性和边界跟踪行为。在这项研究中，作者开发了一种蝴蝶形芯片（图1a），以利用这些运动精子的固有特性，使用几何形状将它们分开，从而产生有利的剪切区，以引导这些细胞向出口移动。
微流体装置是在SOLIDWORKS 2022中设计的；通过数值模拟优化设计后，最终设计由Mizan Microfabrication Technologies (https://mmt-co.com/)使用软光刻技术制造。实验前，使用注射泵将预热至37°C的PBS以高流速泵入芯片，以消除芯片中残留的空气并确保设备运行的生理相关温度。预热的人类输卵管液(HTF)[NaCl、MgSO4·7H2 O、KCl、KH2PO4、CaCl2·2H2O、NaHCO3、丙酮酸钠、Nalactate、葡萄糖、60% 糖浆、青霉素-G、硫酸链霉素、酚红(5%)和牛血清白蛋白(BSA，胚胎测试)]用作精子分离缓冲液。缓冲液和精液样本通过各自的入口同时进入芯片(图1a)，设备运行20分钟。研究中使用了10个精液样本，这些样本的精子浓度>1500万个精子细胞/毫升，形态正常（>4% 正常），平均总活力为49.8%，精子样本被稀释到所需浓度。
为了操作该装置，使用注射泵将原始精液样本和干净的缓冲液引入芯片上。在第二阶段，当精液流与流变区中的缓冲液流交界时，足够运动的精子离开精液并穿透缓冲液流。在第三阶段，成功通过前两个阶段的精子细胞具有足够的运动能力，可以旋转并逆着缓冲液流导航。当精液流与流变区中的干净缓冲液接触时，足够活跃的精子离开精液进入分离缓冲液并沿着引导阵列游动到达出口。因此，蝴蝶形芯片同时利用精子的流变性和边界跟踪行为来提高设备效率和吞吐量。
图1 蝴蝶形芯片（BSC）和分离活动精子的过程
此外，作者进行了参数研究，以优化设备两侧分隔器的长度、方向和间距（图1b），确保有利于精子流变性的均匀流速，因为相对较高的缓冲液速度（Vbuffer >15 μm s−1）可能会阻碍运动精子进入出口。最佳设计允许调整缓冲液流速，将阵列中的流速降低至略低于25 μm s−1以有利于精子流变性（图1c）。此外，还考虑使用辅助出口，不仅可以实现阵列内的流动均匀性，还可以转移一部分缓冲液流。与之前的工作相比，该装置中流变区的尺寸更大，再加上两个辅助出口的排列方式，确保了较高的分离率，使出口中选定精子的浓度比之前的研究高84%。利用这种几何形状，在装置内建立了流速和剪切速率场（图1d和e）。
2.精子选择装置的性能
测试和精液样本的环境和物理条件必须保持不变。测试精液样本的一个关键因素是其浓度，必须在开始测试之前使用HTF稀释进行标准化。为此，在1分钟内研究了六种不同浓度下精子从阵列C1分离的速率。在所有这些实验中，保持2.5 μL min-1的恒定流速。图2a显示了浓度为8000万/毫升时，运动精子分离率最高，与浓度为6000万/毫升和1亿/毫升时相比，分离率分别提高了约48%和91%。
图2 不同精液入口流速下BSC的精子分离率
为了确定精液浓度和操作流速，专门计算了阵列C1中的分离率，因为根据图3a，大约29%的分离精子通过了该阵列，这一比例高于其他阵列。在图3b中，横轴和纵轴分别表示引导阵列中两个通道壁之间的距离和分离精子的曲线速度。根据图3b，大约57%的精子在距离两个阵列50 μm的范围内分离，而剩余部分通过流变性在引导阵列区域的中心区域分离。在确定芯片的最佳工作浓度后，有必要研究不同流速下的最大分离率和精子速度。
为此，在一分钟内检查了阵列C1中七种流速下的分离率（图2b）和分离后的精子的运动参数（图3c）。当精液流速增加到 2.5 μL min−1 时，足够的流速和剪切速率导致分离率增加到每分钟139个精子（图2b），精子的曲线速度增加到C1中的77 μL min−1（图3c）。
然而，在流速高于2.5 μL min−1 时，精液的流速增加到一定程度，一些精子（类似于图3d中的黄色精子）尽管具有运动能力，但无法克服精液流的惯性力并被流水冲走；结果，分离率下降了约81.7%（图2b）。当流速超过2.5 μL min−1 时，分离精子的运动参数会得到改善。具体而言，在流速为3 μL min−1 时，VCL比流速为2.5 μL min−1时高28.7%（图3c）。这些运动参数包括随时间变化的第一个位置和最后一个位置之间的直接路径速度（VSL）、精子头部沿路径曲线运动的速度（VCL）以及精子沿指定路径的平均速度（VAP）。图3f显示了运动精子通过引导区域的运动；这些精子利用流变性和边界跟踪行为向出口游动。综合来看，作者在本研究中选择的流速为2.5μL min−1 ，因为该流速具有最高的分离率，并能保持VCL超过77 μm s−1 ，这适用于ART。
图3 分离精子的参数比较
3.与SU方法的对比
图4a比较了微流控装置和SU方法中的精子分离过程。为了将该装置与SU进行对比，将样品分成两等份，使用芯片处理20分钟，使用SU方法处理60分钟。在确定了合适的芯片工作浓度和流速后，将该芯片与其他传统的精子分离方法（上游法，SU）进行了比较。与SU方法相比，使用蝴蝶形芯片分离的精子的运动参数VCL、VSL和VAP分别平均提高了57.3%、120.9%和115.4%。此外，与原始样品相比，分别提高了147.5%、279.4%和242.8%（图5a）。此外，与最近的研究相比，分离的精子数量有所增加。
图4 微流控装置和SU方法中的精子分离过程
为了评估分离前后精子的运动程度，作者采用了符合世界卫生组织指导方针的四分类系统，并使用计算机辅助精子分析（CASA）进行分析。运动精子以最小速度25 μm s−1（VSL ≥ 25 μm s−1）从起点到终点游动，属于A级或快速前进型。B级或慢速前进型精子以5 < VSL < 25 μm s−1的速度游动。C级或非前进型精子直线路径速度小于5 μm s−1，D级精子没有主动尾部运动。图5b展示了芯片出口处的分离精子，浓度为每毫升410万个精子，分为四个运动等级。分离出的精子中约有66.9%属于A级，这表明该芯片能够分离快速进步的精子并增加IVF的成功率。此外，A + B级精子的数量分别比原始样本和SU方法高212.2%和86.4%（图5c）。
图5 三种条件下精子质量对辅助生殖技术成功的关键参数比较：原始样本、SU和BSC
精子前向活力是男性健康和生育状况的基本指标。本研究将分离精子的前向活力与原始样本和用SU方法分离的精子进行了比较。蝴蝶形芯片、SU方法和原始样本分离的精子的前向活力分别为95.87 ± 2.2%、74.19 ± 7.4% 和49.8 ± 7.1%（图5d）。这表明与原始样本相比，前向活力显著提高了46%。在研究的后续阶段，还评估了分离精子的存活率。高存活率表明分离方法是安全的。如图5f所示，从BSC收集的样本的活力率为97.8%，比原始样本提高了63.3%。
此外，DNA对后代健康的影响是一个重要因素，因此精子DNA分析是分离技术成功的关键参数。在本研究中，分离精子中的精子DNA碎片(SDF)百分比与原始样本和SU方法中的百分比进行了比较（图5e）。结果表明，与原始样本相比，SU方法和蝴蝶形芯片分别将DNA完整性提高了38.5%和80.3%。这证明了蝴蝶形芯片优于传统方法，并凸显了其作为辅助生殖技术成功的重要指标的潜力。
综上，本研究开发了一种蝴蝶形微流控芯片，用于筛选DNA完整性和运动能力强的精子。三阶段选择法利用精子细胞固有的运动特性，确保只有那些运动能力足以克服这些障碍的精子才能被选中。结果表明，A级精子数量比原始样本和SU方法分别高 212.2% 和 86.4%。此外，采用并行化来增加样本通量并提高其性能，在缓冲液和精子流速分别为6.25 μL min-1和 2.5 μL min-1时，分离率最高。精子参数结果表明BSC的性能优于SU方法，总运动能力、DNA 完整性和速度参数(VCL)全部提高。当然，本研究使用了正常精子症患者的样本，未来的工作需要关注浓度和活力较低的样本。
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